大蒜素對(duì)煙曲霉菌感染小鼠的細(xì)胞免疫功能的影響

潘中武，董 群

(皖南醫(yī)學(xué)院 微生物學(xué)與免疫學(xué)教研室，安徽 蕪湖 241002)

曲霉菌在自然界中分布十分廣泛，有多種曲霉菌能引起人類和動(dòng)物感染，其中最常見的是煙曲霉菌(Aspergillus fumigatus，Af)。煙曲霉菌為腐生菌，其孢子直徑小，能在空氣中傳播，人吸入后可在氣道內(nèi)定植、感染［1］。正常人吸入孢子后并不致病，但對(duì)免疫功能低下的人群，可引起侵襲性肺曲霉菌病(invasive pulmonary aspergillus，IPA)。近年來，糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑、抗生素的廣泛應(yīng)用，以及腫瘤的放化療、器官移植、血液透析、艾滋病的流行等都成為侵襲性曲霉菌感染的危險(xiǎn)因素，臨床有效的抗真菌藥物不多，且毒副作用強(qiáng)。IPA預(yù)后不佳，患者的病死率在 56% ～88.1%之間［2，3］。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 昆明種健康小鼠30只，雌雄各半，5～6周齡，體重(20±2)g左右，購(gòu)自南京青龍山動(dòng)物繁殖中心，置于相對(duì)清潔、恒溫環(huán)境中，分籠飼養(yǎng)，自由取水。

1.2 供試菌株 煙曲霉菌(CCCCMIDA1)，購(gòu)于中國(guó)醫(yī)學(xué)真菌中心。

1.3 藥物 大蒜素膠囊，購(gòu)自江蘇正大清江制藥有限公司。

1.4 主要試劑 IL-12、IFN-γ 檢測(cè)試劑盒，購(gòu)自上海森雄科技實(shí)驗(yàn)有限公司。

1.5 實(shí)驗(yàn)分組 將30只昆明種小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、預(yù)防組、治療組，每組10只。實(shí)驗(yàn)前3組小鼠均給予腹腔內(nèi)一次性注射環(huán)磷酰胺(CY)200 mg/kg(CY用NS配制成20 mg/ml注射液，根據(jù)小鼠體重注射不同容量)。實(shí)驗(yàn)時(shí)，預(yù)防組每天灌服1次25 mg/(kg·d)大蒜素溶液 0.5 ml/次 ×14 d;治療組第1～7天灌服等量生理鹽水，第8～14天灌服同劑量大蒜素，對(duì)照組灌服等量生理鹽水14 d。實(shí)驗(yàn)第8天給各組小鼠于麻醉后鼻腔滴入煙曲霉菌孢子懸液 50 μl，孢子濃度為 1.0 ×107/ml。

1.6 實(shí)驗(yàn)指標(biāo)及測(cè)定方法 用75%酒精浸泡消毒小鼠，無菌取出脾臟，常規(guī)制備脾細(xì)胞，用 RPMI 1640完全培養(yǎng)液配成5×106/ml脾細(xì)胞懸液;采用MTT法檢測(cè)T細(xì)胞活性;采用ELISA法檢測(cè)脾細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-12、IFN-γ的表達(dá)水平。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 運(yùn)用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件建立數(shù)據(jù)庫(kù)，數(shù)值變量資料以±s表示，多組均數(shù)間比較采用單因素方差分析(F檢驗(yàn))，多組均數(shù)間兩兩比較采用SNK法(q檢驗(yàn))。

2 結(jié)果

2.1 大蒜素對(duì)小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞增殖活性的影響 預(yù)防組大蒜素灌胃7 d后再感染煙曲霉菌，脾臟T淋巴細(xì)胞增殖活性與對(duì)照組比較，差異有顯著性(P＜0.01)。治療組在感染煙曲霉菌后給予大蒜素治療7 d，脾臟T淋巴細(xì)胞增殖活性與對(duì)照組比較，有顯著性差異(P＜0.01)，預(yù)防組和治療組比較，兩組之間也有差異(P＜0.05)。提示大蒜素能提高小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞增殖活性。

表1 各組小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞增殖活性(±s)Tab 1 Activity of spleen T-lymphocyte proliferation in each group(±s)

表1 各組小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞增殖活性(±s)Tab 1 Activity of spleen T-lymphocyte proliferation in each group(±s)

*表示治療組和預(yù)防組與對(duì)照組之間兩兩比較，P＜0.05，△表示治療組與預(yù)防組之間比較，P＜0.05

組別 n 增殖活性 F值 P值10 0.411 ±0.054預(yù)防組 10 1.015±0.065* 308.52 ＜0.01治療組 10 0.697 ±0.041對(duì)照組＊△

2.2 脾細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IFN-γ表達(dá)水平 由表2可見，預(yù)防組與對(duì)照組比較，IFN-γ水平顯著增高，兩組之間差異顯著(P＜0.01)。治療組IFN-γ水平與對(duì)照組比較，有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。預(yù)防組和治療組之間IFN-γ水平比較，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。

表2 各組小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IFN-γ表達(dá)水平(±s)Tab 2 Level of IFN-γ expression in cultural liquid of spleen cells for each group(±s)

表2 各組小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IFN-γ表達(dá)水平(±s)Tab 2 Level of IFN-γ expression in cultural liquid of spleen cells for each group(±s)

*表示治療組和預(yù)防組與對(duì)照組之間兩兩比較，P＜0.05，△表示治療組與預(yù)防組之間比較，P＜0.05

組別 n IFN-γ 表達(dá)水平(pg/ml) F值 P值10 87.672 ±5.768預(yù)防組 10 190.839±6.958* 733.805 ＜0.01治療組 10 131.562 ±5.283對(duì)照組＊△

2.3 脾細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-12表達(dá)水平 由表3可見，預(yù)防組與對(duì)照組比較，IL-12水平增高顯著，兩組之間差異顯著(P＜0.01)。治療組IL-12水平與對(duì)照組比較，有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。預(yù)防組和治療組之間IL-12水平比較，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

表3 各組小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-12表達(dá)水平(±s)Tab 3 Level of IL-12 expression in supernatant solution of spleen cells for each group(±s)

表3 各組小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-12表達(dá)水平(±s)Tab 3 Level of IL-12 expression in supernatant solution of spleen cells for each group(±s)

*表示治療組和預(yù)防組與對(duì)照組之間兩兩比較，P＜0.05，△表示治療組與預(yù)防組之間比較，P＜0.05

組別 n IL-12表達(dá)水平(pg/ml) F值 P值10 29.084 ±2.095預(yù)防組 10 69.103±3.743* 445.879 ＜0.01治療組 10 50.726 ±2.932對(duì)照組＊△

3 討論

曲霉菌為條件致病菌，在自然界分布廣泛，能引起人類疾病最常見的多為煙曲霉菌。煙曲霉菌常寄生在上呼吸道，其孢子進(jìn)入下呼吸道后定植，在條件適宜時(shí)，則出芽形成菌絲，造成組織破壞，形成IPA。近十年來，隨著免疫抑制患者的不斷增多，呼吸道真菌感染的發(fā)病率逐漸增高，IPA逐漸成為臨床上危害大、病死率高的呼吸道真菌感染，其發(fā)病率甚至已經(jīng)超過了最常見的真菌感染——侵襲性念珠菌病，成為威脅免疫受損宿主生命的嚴(yán)重感染性疾病之一。在秋冬和陰雨季節(jié)，大量吸入煙曲霉菌孢子可引起本病的急性發(fā)作。

IPA早期診斷極為困難，治療成功率很低，患者病死率高。煙曲霉菌在免疫健全宿主及少量菌存在時(shí)一般不致病，僅在長(zhǎng)期的粒細(xì)胞減少、血液系統(tǒng)惡性腫瘤、長(zhǎng)期應(yīng)用糖皮質(zhì)激素、骨髓移植或?qū)嶓w器官移植及AIDS等致機(jī)體免疫力減弱時(shí)，大量煙曲霉菌的入侵才可能發(fā)病，造成組織缺血、壞死;菌絲還可穿透支氣管或細(xì)支氣管壁，形成急性壞死化膿性肺炎，甚至形成空洞。

煙曲霉菌侵入后機(jī)體可啟動(dòng)固有性及獲得性免疫應(yīng)答?？篃熐姑庖咭约?xì)胞免疫為主，在煙曲霉菌感染過程中，肺泡巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞可吞噬和殺傷吸入的孢子，抑制孢子生成菌絲，是抗煙曲霉菌感染的第一道防線，構(gòu)成抗煙曲霉菌的天然免疫。相關(guān)研究表明，在正常機(jī)體內(nèi)，當(dāng)煙曲霉菌侵入下呼吸道時(shí)，巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞迅速聚集于感染部位，釋放多種炎癥因子，體內(nèi)產(chǎn)生Th1型細(xì)胞反應(yīng)，IL-12、IFN-γ等增多，增強(qiáng)效應(yīng)細(xì)胞的抗菌能力，有利于機(jī)體清除煙曲霉菌［4，5］。IL-12、IFN-γ 不僅能增強(qiáng)吞噬細(xì)胞的殺傷活性，而且能夠促進(jìn)初始T細(xì)胞向Th1細(xì)胞方向進(jìn)行分化，活化NK細(xì)胞，降低宿主體內(nèi)鐵負(fù)荷等［6］。

本實(shí)驗(yàn)將大蒜素用于IPA的防治，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大蒜素能提高治療組和預(yù)防組小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞的增殖活性和IL-12、IFN-γ水平，增強(qiáng)機(jī)體抗煙曲霉菌的能力［7，8］，尤其是預(yù)防組。本研究提示堅(jiān)持服用一定量的大蒜素可以為臨床防治IPA提供積極的幫助。

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