一次性注射器的生物相容性研究

程玲，徐玉茵，高勇,2，劉海濤，張娟麗 ，周靜

1.河南省醫(yī)療器械檢驗所 生物室，河南 鄭州 450003；2.浙江大學生物醫(yī)學工程與儀器科學學院，浙江 杭州310027

一次性注射器已廣泛應用于醫(yī)療機構，其質量的好壞與人民群眾的生命安全息息相關。一次性使用注射器屬于體外與體內相接觸中間接與血液接觸類器械，作用時間為A類（<24h）[1]。依據(jù)GB/T16886.1-2001《醫(yī)療器械生物學評價第1部分:評價與試驗》[2-3]，我們選擇了體外細胞毒性試驗、急性毒性試驗、皮內反應和遲發(fā)型超敏反應試驗等對其生物相容性進行研究。

1 試驗材料

1.1 試驗樣品

選擇17批一次性使用注射器，來源于國家抽驗。

1.2 試驗儀器和所需材料

采用超凈工作臺（蘇州凈化設備有限公司，型號：SW-CJ-1C），二氧化碳培養(yǎng)箱（Thermo公司，型號：3111），小鼠成纖維細胞L-929（購自中國科學院上海生命科學研究院細胞庫），酶標儀（Tecan公司，型號：Sunrise RC梯度），MEM/EBSS培養(yǎng)基（賽默飛世爾生物化學制品有限公司），胎牛血清（賽默飛世爾生物化學制品有限公司），胰蛋白酶（Thermo），MTT溶液（Sigma公司），完全弗氏佐劑（Sigma公司），植物油（天津嘉里糧油工業(yè)有限公司），雄性豚鼠(河南康達實驗動物有限公司，合格證號：0007273)，日本大耳白(河南康達實驗動物有限公司，合格證號：0002677），昆明種小鼠（鄭州大學實驗動物中心，合格證：0000909）。

2 試驗樣品的制備[4]

2.1 細胞毒性試驗

同一批號取一次性注射器3支，浸提介質為含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液，無菌條件下，抽取細胞培養(yǎng)液至最大刻度線處，置于37℃的CO2培養(yǎng)箱中24h。陽性對照用5%二甲基亞砜（DMSO），陰性對照材料選用高密度聚乙烯，取高密度聚乙烯適量，按0.2g/mL加入含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，置于37℃培養(yǎng)箱浸提24 h。

2.2 急性全身毒性試驗

浸提介質為0.9%的氯化鈉注射液，同一批號取注射器10支，分別加0.9%的氯化鈉注射液至公稱容量并把芯桿最大容量，兩端封閉，置121℃恒溫箱中保溫1h后取出，把浸提液移入無菌的三角燒瓶內，供24h內使用。同法操作制備植物油浸提液和浸提介質對照液。

2.3 皮內反應試驗

浸提介質為0.9%的氯化鈉注射液，同一批號取注射器3支，分別加0.9%的氯化鈉注射液至公稱容量，兩端封閉，振搖3次，置121℃恒溫箱中保溫1h后取出，供2h內使用。同法操作制備植物油浸提液。取對照液0.9%氯化鈉和植物油各10mL放于無菌三角瓶中，同上方法放置。

2.4 遲發(fā)型超敏反應最大劑量試驗

浸提方法同皮內反應試驗，皮內誘導階段試劑的配置，注射弗氏完全佐劑與生理鹽水以50:50體積比混合的穩(wěn)定乳化劑，試驗樣品液以50:50的體積與穩(wěn)定乳化劑混合后進行皮內注射。

3 試驗方法

3.1 細胞毒性試驗[5]

選取17批國家抽驗的注射器，取生長旺盛的小鼠成纖維細胞L929，胰蛋白酶消化成細胞懸液后，用RPMI1640培養(yǎng)液調整細胞密度至1×104/mL，以100μL/孔接種于96孔培養(yǎng)板，96孔板邊緣孔全部加入無菌PBS200μL，然后置5%CO2培養(yǎng)箱中孵育37℃/24h?？瞻讓φ战M用RPMI1640培養(yǎng)液交換。陰性對照組用高密度聚乙烯浸提液交換，陽性對照組用5%DMSO浸提液。樣品試驗組分別用體積分數(shù)100%、50%（即按1:1用含細胞培養(yǎng)液稀釋）的樣品浸提液每孔100μL交換，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。對試驗樣品組、陰性對照組、陽性對照組及空白對照組的細胞進行顯微檢查，48h后每孔加入20μL（5 mg/mL）MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)5h，小心吸去孔內液體，每孔加入200μL DMSO，振蕩10 min ，用酶標儀主波長570nm ，參考波長630nm處檢測吸光度OD值，取6孔平均值。按下列公式計算相對增殖率（relative growth rate，RGR ，RGR =實驗組OD值/空白對照組OD 值×100 %） 。根據(jù)RGR值，按表1 評分定出材料的毒性級別。

表1 細胞相對增殖度分級標準

3.2 急性全身毒性試驗[6]

隨機選取5批國家抽驗的注射器，選用昆明種小鼠，體重17～20g，隨機將小鼠分為樣品組和對照組，每組10只，其中，各樣品組5只小鼠由尾靜脈恒速注射材料浸提液，對照組5只注射生理鹽水對照液；另外各組5只由腹腔分別注入植物油浸提液和植物油對照液。注射量均為50mL/kg。于注射后4h、24h、48h和72h 觀察小白鼠運動是否減少，觀察并記錄試驗組和對照組動物的一般狀態(tài)、毒性表現(xiàn)和死亡動物數(shù)，在72h時稱量動物體重量。

3.3 皮內反應試驗[7]

隨機選取5批國家抽驗的注射器，日本大耳白兔15只，用75%酒精消毒皮膚暴露區(qū)域，在每只兔脊柱一側選10個點，每點間隔2cm，前5個點皮內注射氯化鈉樣品浸提液，后5個點注射氯化鈉對照液。在每只兔的脊柱另一側注射植物油制備的樣品浸提液和植物油對照液，操作步驟同上。每點注射量0.2mL，注射后24h、48h、72h觀察注射部位的紅斑和水腫的組織反應評分，并記錄試驗結果。72h評分后，分別將每一試驗樣品和溶劑對照的全部紅斑與水腫記分相加，再除以18〔3（動物數(shù)）×3（觀察期）×2（記分類型）〕，計算出每一試驗樣品和每一對應溶劑對照的綜合平均記分。

3.4 遲發(fā)型超敏反應試驗[7]

隨機選取5批國家抽驗的注射器，每組10只豚鼠；另選5只豚鼠做對照。皮內誘導階段：每只豚鼠在約2 cm×4 cm剪毛區(qū)內注射3排（每排2個注射點），第1排注射0.1mL注射弗氏完全佐劑（FCA）與生理鹽水，以50:50體積比混合的穩(wěn)定乳化劑，第2排注射0.1mL樣品浸提液，對照組注射生理鹽水，第3排注射0.1mL樣品浸提液（對照生理鹽水）與穩(wěn)定乳化劑的等比混懸液。局部誘導階段：注射1周后，試驗區(qū)用10%的十二烷基硫酸鈉進行預處理，按摩導入皮膚，然后用樣品浸提液，將20mm×40mm濾紙片浸透后局部貼敷于每只動物的去毛背部試驗區(qū)的誘導注射點部位。用封閉式包扎帶固定敷貼片，并于（48±2）h后除去包扎帶和敷貼片。對照組使用生理鹽水同法操作。激發(fā)階段：誘導14 d后，每只以樣品浸提液或對照液局部貼敷于誘導階段未試驗部位，封閉式包扎帶固定，并于24h除去包扎帶和敷貼片。除去包扎帶后24 h、48h 觀察試驗組和對照組動物激發(fā)部位皮膚情況。按Magnusson和Kligman皮膚致敏的分級標準對每一激發(fā)部位和每一觀察時間皮膚紅斑和水腫反應進行描述并分級。

3.5 統(tǒng)計學處理

4 結果

4.1 細胞毒性試驗

倒置顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，空白對照組及陰性對照組細胞培養(yǎng)24h后，貼壁生長好，細胞呈梭形或不規(guī)則三角形；而陽性對照組細胞很少貼壁，大部分細胞成圓形，核固縮、死亡細胞明顯增多。有4批細胞毒性較大，其余的細胞毒性都在正常范圍之內，試驗結果，見表2。

表2 細胞毒性試驗結果

4.2 急性全身毒性試驗

所有實驗小鼠均無死亡，1組4只、2組3只、5組1只動物精神不好，體質量有所減輕，有輕微反應；4組動物整體體質量增長較少；其他動物精神狀態(tài)良好，活動、進食及大小便均正常，無驚厥、癱瘓、呼吸抑制等毒性反應，體質量均有不同程度的增加，試驗結果，見表3。

表3 試驗樣品對小鼠體質量的影響（±s，g）

表3 試驗樣品對小鼠體質量的影響（±s，g）

組別 生理鹽水 植物油注射前 注射后72h 注射前 注射后72h 1組 19.72±1.56 20.48±2.83 17.98±0.64 18.13±0.95 2組 19.63±1.60 20.70±3.30 17.88±0.88 20.51±1.13 3組 19.98±2.33 23.33±3.60 17.93±1.44 20.24±2.07 4組 19.47±1.81 20.48±2.04 18.12±1.31 19.87±1.37 5組 19.98±1.86 22.54±2.41 17.84±0.48 20.01±1.45對照組 20.01±2.00 21.74±2.66 18.27±1.39 21.79±1.61

4.3 皮內反應試驗

每一試驗樣品：氯化鈉浸提液與氯化鈉對照平均記分之差均為0；植物油浸提液與植物油對照平均記分之差也均<1.0（分別為0.3、0.4、0.2、0.3、0.2）。所以在本試驗條件下，樣品浸提液對皮膚無刺激作用。

4.4 遲發(fā)型超敏反應試驗

陰性對照組動物記分均為0，試驗組動物記分均為0，所以，在本試驗條件下，樣品浸提液對豚鼠無遲發(fā)型致敏作用。

5 討論

在國家抽驗的基礎上，本研究采用體外細胞毒性試驗和體內試驗（急性毒性試驗、皮內反應試驗和致敏試驗）相結合的方法，補充做了一些試驗來探究一次性使用注射器的生物相容性。

不少檢測機構在檢驗一次性使用注射器的細胞毒性時，經(jīng)常會發(fā)現(xiàn)送檢樣品的細胞毒性呈中度或重度，不符合國家標準。據(jù)調查分析，注射器細胞毒性不合格的原因可能有以下3方面因素：

（1）目前，一次性使用注射器的原材料主要是聚丙烯（PP），為了降低生產(chǎn)成本，可能會添加質量較差的PP材料。

（2）注射器滅菌的過程中，PP和橡膠活塞經(jīng)常吸附一定量的環(huán)氧乙烷（EO），如果解析時間不夠的話，殘留的EO就會產(chǎn)生較大的毒性。

（3）在注射器生產(chǎn)過程中，膠塞上使用的硅油不合格，使用工業(yè)硅油代替醫(yī)用硅油，使細胞毒性增加。也有文獻[8]研究表明，注射器細胞毒性較大的原因為活塞的洗液殘留。建議企業(yè)在生產(chǎn)中使用合格的原料，增加EO解析時間，同時改進生產(chǎn)工藝，清除殘留洗液。

由于在以往的試驗中發(fā)現(xiàn)高溫對這一類材料有一定影響，所以本次選取注射器在121℃下浸提1h進行試驗，雖然致敏試驗結果未發(fā)現(xiàn)異常，但個別產(chǎn)品的急性毒性試驗、皮內反應試驗有不同程度的反應，其原因，可能是不同材質高溫浸提還是有影響的。建議在注射器的國家標準中增加體外細胞毒性試驗和體內相關試驗，以較全面地評價產(chǎn)品的質量。

[1]奚廷斐.醫(yī)療器械生物學評價[J].中國醫(yī)療器械信息,1999,5(3):4-9.

[2]國家藥品監(jiān)督管理局.GB/T16886.1-2001《醫(yī)療器械生物學評價第1部分:評價與試驗》[S].北京:中國標準出版出,2001.

[3]李彤,等.40株腸球菌應用兩種儀器鑒定結果的比較研究[J].中國醫(yī)療設備,2009,24(3):55-57.

[4]國家藥品監(jiān)督管理局.GB/T16886.12-2005《醫(yī)療器械生物學評價第12部分:樣品制備與參照樣品》[S].北京:中國標準出版社,2005.

[5]國家藥品監(jiān)督管理局.GB/T14233.2-2005《醫(yī)用輸液、輸血、注射器具檢驗方法第2部分:生物學試驗方法》[S].北京:中國標準出版社,2005.

[6]國家藥品監(jiān)督管理局.GB/T16886.11-1997《醫(yī)療器械生物學評價第11部分:全身毒性試驗》[S].北京:中國標準出版社,1997.

[7]國家藥品監(jiān)督管理局.GB/T16886.10-2005《醫(yī)療器械生物學評價第10部分:刺激與遲發(fā)型超敏反應試驗》[S].北京:中國標準出版社,2005.

[8]何華紅,李薇,吳婷.一次性使用醫(yī)用注射器活塞體外細胞毒性檢測[J].中國醫(yī)療器械雜志,2010,34(2):123-125.