[4（-4-氟苯基）-6-異丙基-2（-N-甲基-N-甲磺?；被┼奏?5-基]甲醇含量測(cè)定和有關(guān)物質(zhì)檢查

謝春燕，徐新軍，劉群娣，閆李麗，謝曉玲（.中山大學(xué)藥學(xué)院，廣州市50006；.廣州中一藥業(yè)有限公司，廣州市 50000）

瑞舒伐他汀鈣（Rosuvastatin calcium）為新型的3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A（HMG CoA）還原酶抑制劑[1]，是第7個(gè)進(jìn)入市場(chǎng)的他汀類(lèi)藥物，是迄今為止最強(qiáng)效的降脂藥物，被譽(yù)為“超級(jí)他汀”[2]，主要用于治療高脂血癥和高膽固醇血癥[3]。

[4-（4-氟苯基）-6-異丙基-2-（N-甲基-N-甲磺?；被┼奏?5-基]甲醇（以下中文名均簡(jiǎn)稱(chēng)為瑞舒伐他汀中間體Ⅵ，英文名為Rosuvastatin intermediateⅥ），是中山大學(xué)藥學(xué)院合成瑞舒伐他汀鈣改進(jìn)工藝時(shí)的第6步反應(yīng)的產(chǎn)物中間體[2]。藥物合成中間體是合成原料藥的重要物質(zhì)，其質(zhì)量直接決定了原料藥和最終成品的質(zhì)量和療效，因此有必要對(duì)藥物合成中間體進(jìn)行質(zhì)量控制。在合成瑞舒伐他汀鈣時(shí)，該中間體反應(yīng)時(shí)技術(shù)難度較高，比較容易引入雜質(zhì)，而其他中間體合成過(guò)程相對(duì)比較簡(jiǎn)單，容易獲得高純度的產(chǎn)品。所以該中間體的純度和雜質(zhì)含量直接決定后續(xù)的合成工作與最終產(chǎn)品的質(zhì)量，研究該中間體的含量測(cè)定方法和有關(guān)物質(zhì)含量測(cè)定方法可考察合成路線(xiàn)是否可行。目前有關(guān)瑞舒伐他汀中間體Ⅵ質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究的文獻(xiàn)報(bào)道僅有其殘留溶劑測(cè)定[4]，本文建立了瑞舒伐他汀中間體Ⅵ含量測(cè)定及其有關(guān)物質(zhì)檢查的高效液相色譜（HPLC）分析方法，對(duì)有效地控制瑞舒伐他汀鈣成品的質(zhì)量具有十分重要的意義。

瑞舒伐他汀中間體Ⅵ及瑞舒伐他汀鈣的化學(xué)結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1。

1 儀器與試藥

1525型HPLC儀、2996型二極管陣列檢測(cè)器、717型自動(dòng)進(jìn)樣器（美國(guó)Waters公司）；Mettler Toledo AG285十萬(wàn)分之一電子天平（瑞士Mettler Toledo公司）。

圖1 瑞舒伐他汀中間體Ⅵ和瑞舒伐他汀鈣的結(jié)構(gòu)式Fig 1 Formula structure of rosuvastatin intermediateⅥand rosuvastatin calcium

瑞舒伐他汀中間體Ⅵ對(duì)照品（批號(hào)：081229，含量：99.88%）；瑞舒伐他汀中間體Ⅵ樣品（批號(hào)：090109、090110、090111）；瑞舒伐他汀中間體 Ⅰ（批號(hào)：081213）、中間體Ⅱ（批號(hào)：081216）、中間體Ⅲ（批號(hào)：081218）、中間體Ⅳ（批號(hào)：081221）、中間體Ⅴ（批號(hào)：081225）、中間體Ⅶ（批號(hào)：081228）均由中山大學(xué)藥學(xué)院制備；乙腈為色譜純，甲醇、磷酸二氫鈉、鹽酸、氫氧化鈉等均為分析純，水為超純水。

2 瑞舒伐他汀中間體Ⅵ含量測(cè)定

2.1 色譜條件

色譜柱：Grace-Alltima C18（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈-0.025 mol·L－1磷酸二氫鈉溶液（57∶43）；檢測(cè)波長(zhǎng)：235 nm；流速：1.0 mL·min－1；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：20 μL。

2.2 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

取瑞舒伐他汀中間體Ⅵ對(duì)照品適量，加甲醇-水（80∶20）溶解制備為濃度約為500μg·mL－1的對(duì)照品溶液；取瑞舒伐他汀中間體Ⅵ樣品適量，加甲醇-水（80∶20）溶解制備成濃度約為500μg·mL－1的樣品溶液；另取瑞舒伐他汀合成中間體Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ適量，分別加甲醇-水（80∶20）制備成濃度約為250μg·mL－1的溶液；取瑞舒伐他汀中間體Ⅱ適量，制備為濃度約為40μg·mL－1的溶液。分別取上述瑞舒伐他汀中間體Ⅵ樣品溶液和瑞舒伐他汀中間體Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ溶液適量，混合均勻，得瑞舒伐他汀中間體Ⅰ～Ⅶ混合樣品溶液。

取瑞舒伐他汀中間體Ⅰ～Ⅶ混合樣品溶液、對(duì)照品溶液、瑞舒伐他汀中間體Ⅵ樣品溶液進(jìn)樣分析，結(jié)果，以瑞舒伐他汀中間體Ⅵ峰計(jì)理論板數(shù)不低于3 000，各峰分離度大于1.5。二極管陣列檢測(cè)器檢查主峰色譜純度角為0.038，閾值為0.307，前者小于后者，表明純度符合規(guī)定。色譜見(jiàn)圖2。

圖2 系統(tǒng)適用性高效液相色譜圖Fig 2 HPLC chromatograms of system suitability

2.3 專(zhuān)屬性試驗(yàn)

取瑞舒伐他汀中間體Ⅵ樣品分別進(jìn)行酸（1 mol·L－1的鹽酸甲醇溶液）、堿（1 mol·L－1的氫氧化鈉甲醇溶液）、氧化（3%的雙氧水）、高溫（取樣品固體少量，電爐加熱至約200℃）、光照（紅外照射7 h，光照強(qiáng)度約2 000 lx）破壞試驗(yàn)，各破壞后樣品分別加入甲醇-水（80∶20）稀釋為500 μg·mL－1的供試液。分別精密吸取上述供試液各5μL，注入液相色譜儀，記錄色譜至主峰保留時(shí)間的2.5倍。結(jié)果，酸、堿、氧化、高溫及光照破壞后的降解產(chǎn)物與主成分有很好分離，詳見(jiàn)圖3。

圖3 破壞試驗(yàn)高效液相色譜圖Fig 3 HPLC chromatograms of destruction tests

2.4 線(xiàn)性范圍

取濃度為260.79 μg·mL－1的對(duì)照品溶液，分別進(jìn)樣5、10、15、20、25、30μL。以濃度（x）為橫坐標(biāo)，峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線(xiàn)性回歸，得線(xiàn)性回歸方程為y＝994 891x－111 953（r＝0.999 9），瑞舒伐他汀中間體Ⅵ檢測(cè)濃度的線(xiàn)性范圍為65.20～391.18 μg·mL－1。

2.5 回收率試驗(yàn)

精密量取5 mL已知濃度（256.76μg·mL－1）的樣品溶液（批號(hào)：090111）3份于25 mL容量瓶中，分別加入4、5、6 mL對(duì)照品溶液（濃度為260.79 μg·mL－1），加甲醇-水（80∶20）稀釋至刻度，平行操作2份。按“2.1”項(xiàng)下條件測(cè)定，低、中、高3個(gè)濃度回收率分別為99.16%、98.73%、100.59%，RSD分別為0.59%、0.67%、1.06%。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

進(jìn)樣重復(fù)性試驗(yàn)：取對(duì)照品溶液重復(fù)進(jìn)樣6次，每次20μL，記錄峰面積，RSD為0.23%。

樣品測(cè)定的重復(fù)性：取瑞舒伐他汀中間體Ⅵ樣品（批號(hào)：090110）6份，精密稱(chēng)定，按“2.2”項(xiàng)下樣品溶液制備方法操作，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算含量平均值為99.48%，RSD為0.69%。

2.7 樣品溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一份瑞舒伐他汀中間體Ⅵ樣品溶液（批號(hào)：090109，濃度：251.58 μg·mL－1），分別于制備后8 h內(nèi)每隔一段時(shí)間進(jìn)樣1次，記錄峰面積。結(jié)果，RSD為0.53%，表明樣品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 樣品含量測(cè)定

稱(chēng)取3批瑞舒伐他汀中間體Ⅵ樣品（批號(hào)：090109、090110、090111）各2份，精密稱(chēng)定，制備為樣品溶液。按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，同時(shí)取對(duì)照品溶液和樣品溶液注入色譜儀，按外標(biāo)法計(jì)算含量，結(jié)果見(jiàn)表1。

3 有關(guān)物質(zhì)檢查

3.1 色譜條件

色譜柱：Grace-Alltima C18（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)

表1 樣品中主成分和有關(guān)物質(zhì)含量測(cè)定結(jié)果Tab 1 Content determination of main component and its related substances in samples

3.2 有關(guān)物質(zhì)檢查方法

取瑞舒伐他汀中間體Ⅵ對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，置于50 mL容量瓶中，加甲醇-水（80∶20）溶解，得濃度為253.90 μg·mL－1的對(duì)照品溶液A。精密量取1 mL對(duì)照品溶液A，至100 mL容量瓶中，加甲醇-水（80∶20）稀釋得濃度為2.54 μg·mL－1的對(duì)照品溶液B（即1%的對(duì)照品溶液A）。取瑞舒伐他汀中間體Ⅵ樣品62.5 mg，精密稱(chēng)定，置于50 mL容量瓶中，加甲醇-水（80∶20）溶解得濃度約為1 250 μg·mL－1的樣品貯備溶液。精密量取5 mL樣品貯備溶液至25 mL容量瓶中，加甲醇-水（80∶20）稀釋得濃度約為250μg·mL－1的樣品溶液。取對(duì)照品溶液B、樣品溶液分別進(jìn)樣20 μL。

3.3 線(xiàn)性關(guān)系考察

取濃度為2.371 μg·mL－1的對(duì)照品溶液（相當(dāng)于樣品溶液的1%），分別進(jìn)樣2、5、10、20、40 μL。以濃度（x）為橫坐標(biāo)，峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線(xiàn)性回歸，得線(xiàn)性回歸方程為y＝51 293x－3 642.4（r＝0.999 5），表明有關(guān)物質(zhì)的檢測(cè)濃度線(xiàn)性范圍為0.24～4.75 μg·mL－1。

3.4 定量限和檢測(cè)限

根據(jù)定量限和檢測(cè)限試驗(yàn)方法進(jìn)行操作，結(jié)果有關(guān)物質(zhì)的檢測(cè)限為195.8 ng·mL－1，定量限為587.5 ng·mL－1。

3.5 重復(fù)性試驗(yàn)

稱(chēng)取瑞舒伐他汀中間體Ⅵ樣品（批號(hào)：090110）6份，精密稱(chēng)定，按“3.2”項(xiàng)下操作，照“3.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定并計(jì)算有關(guān)物質(zhì)的含量。結(jié)果，有關(guān)物質(zhì)含量分別為0.17%、0.18%、0.17%、0.18%、0.17%、0.18%，RSD為0.20%。

3.6 樣品中有關(guān)物質(zhì)含量測(cè)定

稱(chēng)取瑞舒伐他汀中間體Ⅵ樣品（批號(hào)：090109、090110、090111）每批各2份，精密稱(chēng)定，按“3.1”和“3.2”項(xiàng)下方法操作，采用主成分自身稀釋對(duì)照法[5]計(jì)算有關(guān)物質(zhì)的含量，結(jié)果見(jiàn)表1。

4 討論

4.1 色譜條件的選擇

4.1.1 波長(zhǎng)選擇。采用二極管陣列檢測(cè)器對(duì)瑞舒伐他汀中間體Ⅵ在200～400 nm波長(zhǎng)內(nèi)進(jìn)行光譜掃描，發(fā)現(xiàn)在235 nm波長(zhǎng)處有強(qiáng)吸收峰，所以選擇235 nm作為含量測(cè)定的檢測(cè)波長(zhǎng)。經(jīng)掃描，樣品在220 nm波長(zhǎng)處雜質(zhì)峰有明顯吸收，且基線(xiàn)噪音不大，故選用220 nm作為有關(guān)物質(zhì)含量測(cè)定的檢測(cè)波長(zhǎng)。

4.1.2 流動(dòng)相選擇。大多數(shù)瑞舒伐他汀合成中間體呈弱酸性，考慮用緩沖鹽作為流動(dòng)相，參考相同他汀類(lèi)藥物測(cè)定的色譜條件，決定采用0.025 mol·L－1的磷酸二氫鈉溶液[6]（pH＝4.7）。首先以乙腈-0.025 mol·L－1磷酸二氫鈉（40∶60）為流動(dòng)相，測(cè)定瑞舒伐他汀中間體Ⅵ樣品溶液，結(jié)果主峰保留時(shí)間過(guò)長(zhǎng)；后調(diào)整乙腈為60%，結(jié)果主成分在9.6 min出峰；另選擇甲醇-水（70∶30）為流動(dòng)相，取瑞舒伐他汀中間體Ⅰ～Ⅶ混合樣品溶液進(jìn)樣，結(jié)果峰形重疊而且拖尾；又采用乙腈-0.025 mol·L－1磷酸二氫鈉（60∶40），取混合樣品溶液進(jìn)樣，結(jié)果在9～10 min時(shí)有3個(gè)峰明顯重疊；最后流動(dòng)相調(diào)整為乙腈-0.025 mol·L－1磷酸二氫鈉（57∶43），結(jié)果混合樣品中各峰分離較好，主峰與相鄰峰分離度大于1.5，峰形好，故選用乙腈-0.025 mol·L－1磷酸二氫鈉（57∶43）為流動(dòng)相進(jìn)行測(cè)定。

4.2 主成分自身稀釋對(duì)照法

本品無(wú)相應(yīng)雜質(zhì)的對(duì)照品，且雜質(zhì)含量低，不適合用面積歸一化法計(jì)算雜質(zhì)含量。主成分自身稀釋對(duì)照法是通過(guò)稀釋樣品溶液作為雜質(zhì)對(duì)照計(jì)算雜質(zhì)含量，適用于無(wú)法得到雜質(zhì)對(duì)照品的化合物的有關(guān)物質(zhì)含量測(cè)定，故本文選用此法進(jìn)行測(cè)定。通過(guò)考察瑞舒伐他汀中間體Ⅵ樣品色譜圖雜質(zhì)峰情況，將雜質(zhì)限量定為1%，以樣品溶液的1%作為對(duì)照溶液計(jì)算樣品雜質(zhì)的含量（計(jì)算雜質(zhì)含量時(shí)，任何小于主峰面積0.05倍的峰忽略不計(jì)）。

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