豬繁殖與呼吸綜合征病毒Nsp7的原核表達及其多克隆抗體的制備

劉 鶴，劉永剛，石文達，王淑杰，武嘉男，董建國，榮福龍，李麗琴，徐明明，孫 剛，蔡雪輝*

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，黑龍江哈爾濱150030；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點實驗室/動物疫病診斷中心，黑龍江哈爾濱150001；3.黑龍江省動物衛(wèi)生監(jiān)督所，黑龍江哈爾濱150090)

豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是由PRRS病毒(PRRSV)引起的，以母豬繁殖障礙，仔豬、育肥豬呼吸道疾病為臨床癥狀的病毒性傳染病。該病在1987年首次報道于美國，并呈全球性流行[1]。PRRSV分為歐洲型(Ⅰ型)和北美洲型(Ⅱ型)兩種基因型[2]。郭寶清等于1996年首次在我國分離到PRRSV CH-1a株，我國流行的PRRSV的基因型主要為北美洲型[3]。2006年夏季至今，高致病性PRRSV引起PRRS的爆發(fā)與流行，給我國養(yǎng)豬業(yè)造成嚴重的經(jīng)濟損失[4]。

PRRSV屬于動脈炎病毒科(Arteriviridae)動脈炎病毒屬(Arterivirus)，單股正鏈RNA病毒，基因組全長約15.4 kb，包括9個ORF，其中ORF1a、ORF1b編碼病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白(Nonstructural protein，Nsp)，ORF2～ORF7編碼病毒的結(jié)構(gòu)蛋白[2]。ORF1a和ORF1b編碼多聚蛋白pp1a和pp1ab，最終可以水解為14個Nsp[5]，在PRRSV的復(fù)制過程中起重要作用[6]。目前Nsp7的結(jié)構(gòu)及其在PRRSV復(fù)制周期中的作用尚未明確，研究顯示Nsp7抗體產(chǎn)生時間早，抗體水平高，持續(xù)時間長，表明Nsp7與機體免疫應(yīng)答關(guān)系較為密切[7]。由于Nsp7基因在Nsp中相對保守，不同病毒株之間差異變化較小，因此適于作為檢測抗原檢測不同病毒株的抗體水平[8]。本研究采用原核表達系統(tǒng)表達了Nsp7，并制備了抗Nsp7的多克隆抗體。實驗結(jié)果顯示Nsp7具有良好的免疫原性，為進一步揭示PRRSV Nsp7抗體水平變化和抗原定位奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 病毒株、血清、菌株與載體 PRRSV HuN4株、PRRSV豬陽性血清和陰性血清、pET30a(+)、大腸桿菌JM109、BL21(DE3)均由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所動物疫病診斷中心保存。

1.2 主要試劑 總RNA提取試劑盒購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；反轉(zhuǎn)錄酶、TaqDNA聚合酶、T4 DNA連接酶、pMD18-T試劑盒、限制性內(nèi)切酶等均購自TaKaRa公司；質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒購自愛思進生物技術(shù)有限公司；DNA膠回收試劑盒購自上海華舜生物技術(shù)有限公司；濃縮型DAB試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；辣根過氧化物酶(HRP)標記的抗豬IgG、異氰酸熒光素(FITC)標記的羊抗鼠IgG和抗豬IgG購自Sigma公司；鎳離子親和純化柱購自GE公司。

1.3 引物設(shè)計與合成 參照GenBank中登錄的PRRSV HuN4株全基因組序列(AF635006)，設(shè)計引物用于擴增PRRSV HuN4株Nsp7基因。引物中引入BamHⅠ和HindⅢ酶切位點(下劃線部分)，由北京三博志遠生物技術(shù)有限公司合成。引物序列為：上游引物：5'-CGGATCCTCGCTGACTGGTGCCC TC-3'；下游引物：5'-GCGCGGAAGCTTTTCCCACT GAGCTCT-3'。

1.4 病毒RNA的提取 取凍結(jié)保存的PRRSV HuN4株細胞培養(yǎng)液，按照UNIQ-10柱式TRIzol總RNA提取試劑盒操作說明書提取病毒RNA。

1.5 病毒基因RT-PCR擴增 以提取的病毒RNA為模板，進行RT-PCR擴增Nsp7基因。PCR反應(yīng)條件為：95℃5 min；94℃ 1 min、58℃ 1 min、72℃1 min，35個循環(huán)；72℃10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定并切膠回收。

1.6 重組質(zhì)粒的構(gòu)建 Nsp7基因PCR產(chǎn)物經(jīng)BamHⅠ和HindⅢ雙酶切后與經(jīng)同樣酶切處理的pET30a(+)載體連接，轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細胞。提取重組質(zhì)粒，進行PCR和雙酶切鑒定，重組質(zhì)粒pET-Nsp7由上海英駿生物技術(shù)公司測序。

1.7 Nsp7的表達、可溶性和反應(yīng)原性分析 將pET-Nsp7轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞，構(gòu)建重組菌pET-Nsp7/BL21。重組菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達，收集誘導(dǎo)后菌體并超聲破碎，離心后收集上清液和沉淀，SDS-PAGE試驗分析Nsp7的表達與可溶性，以PRRSV陽性血清和陰性血清為一抗，HRP標記的抗豬IgG為二抗進行western blot試驗，分析Nsp7的反應(yīng)原性。

1.8 Nsp7重組蛋白的純化 以優(yōu)化的誘導(dǎo)條件進行Nsp7的誘導(dǎo)表達，按His Trap FF組氨酸標簽融合蛋白純化手冊進行蛋白純化。

1.9 Nsp7多克隆抗體的制備及其抗體效價的測定以純化后的Nsp7免疫BALB/c小鼠，每次免疫50 μg～100 μg，分別間隔2周進行二免和三免，同時設(shè)陰性對照。三免3 d后采血，采用間接ELISA測定抗體效價。

1.10 Nsp7多克隆抗體IFA檢測 將Marc-145細胞在24孔板培養(yǎng)4 d(37℃5%CO2)，接種PRRSV再培養(yǎng)2 d。每孔加1.5 mL等體積比丙酮和甲醇混合液固定細胞，以200倍稀釋的多克隆抗體作為一抗，稀釋到工作濃度的FITC標記的羊抗鼠IgG作為二抗，同時設(shè)PRRSV陽性豬血清和免疫前小鼠陰性血清為對照，進行IFA試驗。

2 結(jié)果

2.1 Nsp7基因的擴增與重組質(zhì)粒pET-Nsp7的構(gòu)建 以提取的PRRSV HuN4株總RNA為模板，經(jīng)RT-PCR擴增后得到大約800 bp的片段，與預(yù)期大小相符。重組質(zhì)粒pET-Nsp7經(jīng)BamHⅠ和HindⅢ雙酶切后得到約5400 bp和800 bp的兩個片段，與預(yù)期大小相符(圖1)；重組質(zhì)粒測序結(jié)果顯示擴增的Nsp7基因片段為777 bp。

2.2 重組Nsp7蛋白的表達及純化 SDS-PAGE結(jié)果顯示，pET-Nsp7轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)中經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，目的蛋白獲得表達，其分子量約38.5 ku(圖2)。

2.3 Nsp7的反應(yīng)原性 以PRRSV陽性血清和陰性血清作為一抗，HRP標記的抗豬IgG為二抗，進行western blot檢測，結(jié)果顯示：重組Nsp7與PRRSV陽性血清作用后，在38.5 ku處出現(xiàn)一條清晰的特異性反應(yīng)條帶，陰性血清則無反應(yīng)條帶(圖3)，表明誘導(dǎo)表達的重組Nsp7能夠被PRRSV陽性血清特異性識別，具有良好的反應(yīng)原性。

2.4 多克隆抗體效價的檢測 將重組Nsp7免疫小鼠，三免3 d后采血，采用間接ELISA測定抗體效價。結(jié)果顯示，三免后多克隆抗體效價達1∶32000以上(表 1)。

2.5 多克隆抗體的IFA檢測 以制備的多克隆抗體作為一抗，F(xiàn)ITC標記的羊抗鼠IgG為二抗進行IFA試驗。結(jié)果顯示，多克隆抗體和PRRSV豬陽性血清均能夠識別PRRSV感染的Marc-145細胞，并產(chǎn)生熒光信號，而陰性對照則無熒光產(chǎn)生。表明制備的多克隆抗體能夠特異性識別PRRSV的Nsp7(圖4)。

表1 間接ELISA測定多克隆抗體效價Table 1 ELISA titer of the antiserum against Nsp7

3 討 論

按歐洲型PRRSV Lelystad株各Nsp劃分，Nsp7起止位置為 Ser2083～Glu2351，北美 洲 型 PRRSV VR-2332株Nsp7的起止位置為Ser2200～Glu2458氨基酸[9]。因為HuN4株與VR-2332株相比，在Nsp2區(qū)域存在2處共30個氨基酸的缺失[10]，所以HuN4株Nsp7的起止位置為 Ser2170～Glu2428。Nsp7由 777個堿基編碼，共259個氨基酸。目前，PRRSV Nsp7的結(jié)構(gòu)和功能尚未見報道，它在病毒復(fù)制周期中的作用仍不明確。

本實驗構(gòu)建了pET-Nsp7高效重組表達質(zhì)粒，應(yīng)用原核表達系統(tǒng)以融合蛋白的形式高效表達了重組Nsp7。重組Nsp7以可溶形式表達，能夠保持天然構(gòu)象。通過鎳離子親和層析，獲得了高純度的重組蛋白。重組蛋白與PRRSV陽性血清進行的western blot試驗表明其具有良好的反應(yīng)原性，具備作為檢測抗原的優(yōu)勢，可以作為間接ELISA檢測的包被抗原，為研究豬體Nsp7抗體水平的消長規(guī)律奠定了基礎(chǔ)；而且高純度的重組蛋白有利于進一步開展Nsp7結(jié)構(gòu)和功能的研究。利用純化的重組蛋白免疫小鼠制備的多克隆抗體，其間接ELISA效價較高，IFA試驗表明其能夠特異識別PRRSV感染Marc-145細胞后產(chǎn)生的Nsp7，顯示出重組蛋白具有良好的免疫原性。制備的多克隆抗體為進一步研究Nsp7的亞細胞定位奠定了基礎(chǔ)。

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