基因芯片方法檢測6種動物源性人獸共患病病原

王振全，羅寶正，薄清如，徐海聶，沙才華，廖秀云，陳偉生

(1.吉林大學(xué)農(nóng)學(xué)部畜牧獸醫(yī)學(xué)院，吉林長春130062；2.珠海出入境檢驗檢疫局國家外來病檢測重點實驗室，廣東珠海519015)

H5亞型禽流感病毒(Avian influenza virus serotype H5， AIV-H5)、狂犬病病毒(Rabies virus，RV)、豬鏈球菌2型(Streptococcus suis2)、炭疽芽孢桿菌(Bacillus anthracis)、沙門氏菌(Salmonella)、大腸桿菌O157(Escherichia coliO157)6種動物源性人獸共患傳染病病原給人們的健康和生活造成了很大的危害。但是目前對于上述病原的檢測多以一種或少數(shù)幾種細(xì)菌或病毒為主，很少將人獸共患的細(xì)菌和病毒同時檢測。在進出境口岸檢驗過程中對冷凍肉類及蛋類制品往往要求多個項目同時進行，可能同時涉及到檢驗多種細(xì)菌和病毒。在這種情況下，傳統(tǒng)的檢驗方式難以滿足快速、精確的檢驗要求。

基因芯片是具有高通量、集成化、微型化、自動化并且快速、特異性強等特點，目前已廣泛應(yīng)用于病原微生物檢測[1-3]、細(xì)菌耐藥性監(jiān)測與藥物篩選[4]、基因多態(tài)性和基因突變分析[5-7]、轉(zhuǎn)基因食品檢測[8-9]等領(lǐng)域。本研究根據(jù)基因芯片核酸分子雜交的原理，建立一種可同時檢驗上述6種病原體的快速、靈敏、特異的基因芯片方法，為口岸檢測及工商執(zhí)法提供技術(shù)支撐。

1 材料和方法

1.1 病毒株和菌株 H5N1 AIV滅活病毒株購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所；RV、甲型H1N1流感病毒、犬瘟熱病毒(CDV)和犬細(xì)小病毒(CPV)均為疫苗毒；S.suis2滅活抗原購自江蘇出入境檢驗檢疫局；Salmonella、大腸桿菌E.coliO157、志賀氏菌(Shigella)、單增李斯特菌(L.monocytogenes)、H4N6和H6N2 AIV株由珠海出入境檢驗檢疫局分離保存；炭疽芽孢桿菌(B.anthracis)的陽性模板使用合成DNA的克隆菌。

1.2 主要試劑和儀器 DNA/RNA磁珠提取試劑盒購自深圳易瑞生物技術(shù)有限公司；One Step RT-PCR Kit、PCR Amplification Kit、DL Mark 2000 購自寶生物工程(大連)有限公司；生物芯片反應(yīng)儀系統(tǒng)購自臺灣晶宇公司。

1.3 引物和探針設(shè)計及合成 根據(jù)GenBank中AIV-H5、RV、S.suis2、B.anthracis、Salmonella和E.coliO157的保守基因序列，利用Clustal X比對，利用Primer Express 2.0設(shè)計特異性引物和探針。在上游引物的5'端標(biāo)記生物素Biotin，在探針的5'端連接Poly(T)，由上海超世生物科技公司合成(表1)。

1.4 6種病原PCR產(chǎn)物的制備 用磁珠法提取6種病原的核酸，利用上述引物，對AIV-H5和RV進行One Step RT-PCR擴增，反應(yīng)體系為50 μL，反應(yīng)條件為 50℃ 30 min；94℃ 3 min、94℃ 30 s、55℃ 30 s、72℃ 40 s，35個循環(huán)；72℃ 10 min。對S.suis2、B.anthracis、Salmonella和E.coliO157擴增時使用PCR Amplification Kit，體系為50 μL，反應(yīng)條件為 94℃ 3 min；94℃ 30 s、55℃ 30 s、72℃40 s、35個循環(huán)；72℃10 min。

1.5 芯片的制備 將合成的探針用探針稀釋液調(diào)整濃度至40 μmol/L，進行點樣，點樣矩陣見表2，點樣后室溫干燥10 min，在紫外交聯(lián)儀固定(254 nm，1.2 J，7 min～13 min)，Milli-Q水洗滌3次，95%乙醇浸潤20 s，50℃干燥10 min。以Poly(T)-Biotin為陽性對照，探針稀釋液為空白對照，與本研究中各靶基因沒有任何同源性的植物葉綠素的基因為陰性對照。

表1 引物和探針Table 1 Primers and probes

表2 探針點樣示意圖Table 2 Distribution dots of the microarray

1.6 芯片雜交溫度優(yōu)化試驗 取6種病原的PCR產(chǎn)物各 10 μL與 200 μL的 DR.雜交緩沖液充分混合，沸水變性6 min，轉(zhuǎn)移至冰上10 min；將上述混合物轉(zhuǎn)移至芯片室內(nèi)，平鋪均勻，分別在45℃、47℃、49℃、51℃溫度下雜交45 min～60 min，選擇最佳雜交溫度。棄雜交液，用DR.洗滌液洗滌3次；于雜交室中加0.2 μL Strep-AP和 200 μL封閉液的混合液，室溫反應(yīng)30 min，棄封閉液，以DR.洗滌液洗滌3次，吸除芯片上殘留的水分；每個芯片室加 4 μL NBT/BCIP 和 196 μL DR.檢測液的混合液，置于暗室反應(yīng)5 min～10 min，棄去檢測液，水洗至雜交點清晰為止，用芯片反應(yīng)儀讀取結(jié)果。

1.7 芯片雜交特異性試驗 分別用6種病原的引物，對參考病毒株和菌株進行PCR擴增，將擴增產(chǎn)物與芯片進行雜交，用于檢驗各自對應(yīng)病原的特異性(表 3)。

1.8 芯片雜交靈敏度試驗 對提取6種病原核酸定量，分別10倍倍比稀釋為7個梯度，利用各梯度核酸作為模板進行PCR，擴增產(chǎn)物分別與芯片雜交，每個梯度重復(fù)雜交兩次。同時對稀釋的各模板梯度做PCR或RT-PCR和熒光PCR，與芯片的靈敏度進行比較。PCR和RT-PCR反應(yīng)體系及條件同1.4，熒光PCR使用One Step RT-PCR試劑盒，反應(yīng)條件均為：50℃30 min；94℃ 2 min，95℃ 10 s，55℃40 s，40個循環(huán)。6種病原核酸濃度梯度分別為：AIV-H5：2.86×104pg/μL～2.86×10-2pg/μL；RV：2.25 ×104pg/μL ～2.25 ×10-2pg/μL；S.suis2：1.51×104pg/μL ～1.51 ×10-2pg/μL；B.anthracis：8.9 ×10 pg/μL ～8.9 ×10-5pg/μL；Salmonella：1.38×10 pg/μL～1.38×10-5pg/μL；E.coliO157：1.05×102pg/μL～1.05×10-4pg/μL。

1.9 樣品檢測 對禽類咽肛拭子589份、豬的鼻腔拭子185份、肉樣58份、皮革制品24份以及未注射狂犬疫苗的犬只的唾液樣品16份，提取核酸擴增后與基因芯片雜交，分別對6種病原進行檢測，將雜交結(jié)果與熒光PCR結(jié)果比較。

表3 特異性試驗分組Table 3 Group of specificity test

2 結(jié)果

2.1 6種病原PCR擴增 對AIV-H5、RV、S.suis2、B.anthracis、Salmonella和E.coliO157進行擴增，得到預(yù)期目的片段，表明各病原引物特異性良好。

2.2 雜交溫度優(yōu)化試驗 將PCR擴增的6種病原產(chǎn)物與檢測芯片分別在45℃、47℃、49℃和51℃溫度條件下進行雜交，試驗結(jié)果顯示，在47℃時雜交信號最強，雜交斑點最清晰并且背景信號在可接受范圍內(nèi)，所以確定最佳雜交溫度為47℃(圖1)。

2.3 雜交特異性試驗 分別使用本研究中所檢測6種病原的引物，對表3中所列的參考病毒株和菌株進行PCR擴增，將擴增產(chǎn)物分別與芯片雜交檢驗6種病原的特異性，結(jié)果表明，AIV-H5、RV、S.suis2、B.anthracis、Salmonella和E.coliO157在芯片對應(yīng)的位置上出現(xiàn)雜交信號，與每種病原相似的其他參考病原無雜交信號出現(xiàn)，表明芯片的特異性良好(圖 2)。

2.4 芯片靈敏度試驗 分別采用芯片雜交、常規(guī)PCR和Real-time PCR 3種方法比較檢測6種病原的靈敏度。基因芯片檢測AIV-H5、RV、S.suis2、B.anthracis、Salmonella、E.coliO157的靈敏度分別為 2.86×10-2pg/μL、2.25×10-2pg/μL、1.51×102pg/μL、8.9×10-4pg/μL、1.38×10-5pg/μL、1.05×10-3pg/μL(圖3)。檢測結(jié)果比較表明，基因芯片的靈敏度明顯高于常規(guī)PCR 10～100倍，略高于熒光PCR(表4)。

2.5 樣品檢測 利用基因芯片對待測樣品進行檢驗，檢測到AIV-H5陽性0份(0/589)；E.coliO1571份(1/58)；S.suis20 份(0/185)；RV 0 份(0/16)；B.anthracis0 份(0/24)；Salmonella2 份(2/58)，結(jié)果與熒光PCR檢測結(jié)果符合為100%。

表4 3種方法檢測6種病原的最低濃度Table 4 The minimum detection concentration of three methods

3 討 論

目前，利用基因芯片技術(shù)檢測動物傳染病所采用的顯色標(biāo)記物主要有熒光標(biāo)記和非熒光標(biāo)記兩種。本研究中對靶基因的上游引物5'端標(biāo)記了生物素Biotin，在雜交時只有PCR產(chǎn)物和探針有高度互補序列時出現(xiàn)雜交信號，這樣提高了雜交特異性。靈敏度最低可檢測到10-5pg/μL，不低于熒光標(biāo)記方法，略高于熒光定量PCR，高于常規(guī)PCR 10倍。但是對S.suis2的靈敏度只能達(dá)到100 pg/μL，這可能與S.suis2的基因組較大而含有靶基因拷貝數(shù)較少有關(guān)系，需作進一步研究。而且，針對同一種方法不同病原之間其靈敏度也有所差別。特異性試驗表明6種病原之間互不干擾，無交叉反應(yīng)，在實驗室檢驗上述6種病原時可以滿足實際檢驗需要。

本研究中根據(jù)本地出入境口岸實際需要，制備了可同時檢測6種動物源性人獸共患病病原的基因芯片并同時建立了其檢測方法。但是本實驗尚未達(dá)到基因芯片高通量檢驗，將需要進一步研究。

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