牛瑟氏泰勒蟲MPSP雙表位基因的克隆及原核表達(dá)

錢年超，賈立軍，薛書江，張 影，張守發(fā)

(延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院/動物醫(yī)學(xué)系，吉林 延吉 133002)

牛瑟氏泰勒蟲(Theileria sergenti)是由泰勒蟲科(Theileriidae)、泰勒蟲屬(Theileria)的瑟氏泰勒蟲寄生于紅細(xì)胞和淋巴細(xì)胞內(nèi)引起的一種血液原蟲[1-2]。該病以高熱、貧血、消瘦和體表淋巴結(jié)腫大為主要臨床癥狀。由于近幾年來經(jīng)貿(mào)活動的頻繁和養(yǎng)牛業(yè)的規(guī)模化，該病的流行區(qū)逐漸擴(kuò)大，特別是該病對外地引進(jìn)牛、純種牛和改良雜種牛的危害大，已成為嚴(yán)重影響?zhàn)B牛業(yè)的疾病之一[3-4]。T.sergenti的抗原成分復(fù)雜，其中主要表面蛋白(P33和P32)具有較好的免疫原性，在抗T.sergenti感染中具有重要作用[5]。近年來，國內(nèi)外學(xué)者對此研究較深，但是，一直以來，研制的疫苗未能給動物機(jī)體帶來穩(wěn)定、有效的免疫?；赥.sergenti疫苗的研究現(xiàn)狀，本實(shí)驗(yàn)根據(jù)文獻(xiàn)[6]證實(shí)的表位(E1：DTSKFTPTVA HRLKHAEDLF；E2：APDAFGTGKVYDFVGNFKVT KVKFE)，結(jié)合表位分析軟件，篩選出主要表面蛋白的2個優(yōu)勢抗原表位并串聯(lián)成雙表位融合基因，進(jìn)行了原核表達(dá)，為構(gòu)建安全有效的多表位T.sergenti疫苗提供基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料 牛血液和血清樣本采自吉林省延邊州某牧場；DNA提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒小量提取試劑盒、ExTaq酶、T4連接酶、pMD18-T載體、pGEX-4T-2載體、限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和XhoⅠ等均購自TaKaRa公司；大腸桿菌DH5α和BL21由預(yù)防獸醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 引物的設(shè)計與合成 根據(jù)T.sergentiMPSP(Major piroplasm surface protein)基因序列(FJ515689.1)，應(yīng)用Primer Premier 5.0和Oligo 6.31軟件設(shè)計了2對引物，P1、P2為表位E1的引物，P3、P4為表位E2的引物，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，引物序列為P1：5'-CGGGATCCGCCAATGA GGGATACCGT-3'； P2： 5'-ACCAGAACCTCCACCT CCAGATCCACCTCCACCCCATTCCTTGTCGCTCTT C-3'； P3： 5'-GGATCTGGAGGTGGAGGTTCTGGTG GTGGAGGATCTGGTCTTTTTGCCCCTG-3'； P4：5'-CCGCTCGAGCTTTGACTGCGGTGTATTT-3'。

下劃線為BamHⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)；方框內(nèi)為linker(Gly4Ser)3的核苷酸序列。

1.3 目的片段的擴(kuò)增 以DNA提取試劑盒提取的T.sergenti基因組DNA為模板，以P1和P2為引物，擴(kuò)增E1表位基因；以P3和P4為引物，擴(kuò)增E2表位基因，將2次PCR回收DNA產(chǎn)物作為模板，以Pl和P4為引物，擴(kuò)增得到雙表位基因融合產(chǎn)物。

1.4 目的基因的克隆及鑒定 將純化的雙表位基因融合產(chǎn)物與pMD18-T載體4℃連接過夜，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，氨芐青霉素(Amp)篩選陽性克隆，PCR和酶切鑒定并測序。

1.5 原核重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定 用BamHⅠ、XhoⅠ雙酶切陽性克隆質(zhì)粒和pGEX-4T-2，用DNA凝膠回收試劑盒回收酶切產(chǎn)物，用T4 DNA連接酶16℃連接過夜，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞，氨芐青霉素(Amp)篩選陽性克隆，PCR和酶切鑒定并測序。

1.6 重組質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達(dá) 將陽性轉(zhuǎn)化菌和pGEX-4T-2載體菌接種于LB培養(yǎng)基中，37℃振搖培養(yǎng)過夜，取100 L過夜培養(yǎng)物繼續(xù)培養(yǎng)至OD600nm值為0.6～1.0，IPTG誘導(dǎo)4 h，收集陽性轉(zhuǎn)化菌和pGEX-4T-2載體菌的沉淀。

1.7 表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析 用100 μL PH7.4的PBS重新懸浮收集的沉淀，加入等體積的2×SDS上樣緩沖液，煮沸10 min，取20 μL上清進(jìn)行SDS-PAGE電泳，分析蛋白的表達(dá)情況。

1.8 表達(dá)產(chǎn)物的western blot分析 將凝膠上的蛋白帶轉(zhuǎn)移到NC膜上，用10 mL封閉液封閉過夜，分別用T.sergenti血清10 mL(1∶100)和酶標(biāo)羊抗牛IgG 10 mL(1∶2000)作用2 h，DAB顯色，檢測表達(dá)蛋白的反應(yīng)原性。

2 結(jié) 果

2.1 目的基因的擴(kuò)增、克隆及鑒定 以T.sergenti基因組DNA為模板，以P1和P2為引物，擴(kuò)增E1表位基因長度約為180 bp；以P3和P4為引物，擴(kuò)增E2表位基因長度約為130 bp。將2次PCR回收的DNA產(chǎn)物作為模板，以Pl和P4為引物，PCR擴(kuò)增得到雙表位基因融合產(chǎn)物，長度約為360 bp(圖1)。將360 bp的目的基因克隆到pMD18-T載體，經(jīng)PCR和酶切鑒定為陽性。

2.2 原核重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定 將雙表位融合基因連接pGEX-4T-2，構(gòu)建pGEX-4T-E1-2重組表達(dá)載體。經(jīng)PCR及酶切鑒定結(jié)果，表明pGEX-4TE1-2重組表達(dá)載體構(gòu)建成功(圖2)。

2.3 表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析 陽性轉(zhuǎn)化菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)4 h，SDS-PAGE電泳顯示在約39 ku處有一清晰的蛋白條帶(圖3)，與預(yù)期的蛋白分子量大小一致。

2.4 表達(dá)產(chǎn)物的western blot分析 表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE電泳后，轉(zhuǎn)印至NC膜上進(jìn)行western blot鑒定，出現(xiàn)清晰條帶，表明表達(dá)產(chǎn)物具有良好的反應(yīng)原性(圖4)。

3 討 論

T.sergenti寄生于牛的紅細(xì)胞和淋巴細(xì)胞中，研制刺激機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞免疫的疫苗是預(yù)防該病的主要手段。單表位或者多表位疫苗與其他疫苗能誘導(dǎo)機(jī)體更強(qiáng)的細(xì)胞免疫[7]，所以，選擇合適的表位，通過適當(dāng)?shù)拿庖叻绞?，對預(yù)防細(xì)胞內(nèi)寄生的T.sergenti尤為重要。

目前，國內(nèi)外對T.sergenti表位的研究甚少，本實(shí)驗(yàn)室結(jié)合表位分析軟件，確定了兩個優(yōu)勢抗原表位，兩個表位主要誘導(dǎo)細(xì)胞免疫，其中Th1細(xì)胞可以產(chǎn)生大量的IFN-γ。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇的兩個表位能作為疫苗替代全蛋白疫苗，并發(fā)揮表位疫苗的優(yōu)勢。

本實(shí)驗(yàn)研究的雙表位基因的表達(dá)效率高，表達(dá)產(chǎn)物可溶性好，而且具有良好的反應(yīng)原性，這可能是由于選擇表位時，除去了全蛋白的疏水區(qū)，精確地保留了完整的抗原表位。

本實(shí)驗(yàn)通過western blot分析結(jié)果表明原核表達(dá)的蛋白對T.sergenti陽性血清有反應(yīng)原性，其免疫保護(hù)效果還有待后續(xù)的動物試驗(yàn)，將通過篩選表位，選擇T細(xì)胞和B細(xì)胞表位組成的復(fù)合表位或者制備疫苗，既可以多種遺傳背景的MHC分子識別，擴(kuò)大免疫范圍；又能引起強(qiáng)烈的體液和細(xì)胞免疫，綜合防治T.sergenti病。

[1]張守發(fā),許應(yīng)天,梁晚?xiàng)?間接熒光抗體試驗(yàn)對牛瑟氏泰勒蟲病的診斷[J].中國獸醫(yī)科技，2003，33(8)：59-61.

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[3]張守發(fā)，許應(yīng)天，宋繼臣，等.琿春市牛瑟氏泰勒蟲精的調(diào)查研究[J].延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)學(xué)報，1997，19(1)：52-54.

[4]李娟，許應(yīng)天，張西臣，等.牛瑟氏泰勒蟲P33-P23核酸疫苗研究[J].中國獸醫(yī)學(xué)報，2008，28(10)：1171-1173.

[5]許應(yīng)天，高旭，武振久，等.以p33重組蛋白為抗原建立牛瑟氏泰勒蟲病間接ELISA診斷方法[J].中國獸醫(yī)雜志，2007，43(4)：13-14.

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