新型鴨肝炎病毒的分離鑒定及VP1基因序列分析

趙金花，沈志強(qiáng)，朱 輝，李 峰1,，甄洪花，苗立中1,，單 虎

(1.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東濱州256600；2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山東青島266109；3.山東綠都生物科技有限公司，山東濱州256600)

鴨病毒性肝炎(Duck viral hepatitis，DVH)是由DVH病毒(Duck hepatitis virus，DHV)引起雛鴨的一種以肝臟病變?yōu)橹饕±碜兓募毙灾滤佬詡魅静?。近年?lái)，國(guó)內(nèi)外相繼報(bào)道了新型DHV(N-DHV)。2002年，蘇敬良等從北京和廣西分離到2株與DHV-1及DHV-3型無(wú)血清學(xué)相關(guān)性的DHV，并將其定為N-DHV[1]。范書(shū)才等對(duì)從廣東分離的DHV GD株進(jìn)行生物學(xué)和理化學(xué)特性以及交叉中和試驗(yàn)，鑒定結(jié)果表明GD株的抗原性與DHV-1無(wú)關(guān)，屬于N-DHV[2]。2007年，Tseng等在臺(tái)灣發(fā)現(xiàn)一株新型DHV[3-4]，同年Kim等在韓國(guó)也發(fā)現(xiàn)了一株N-DHV，并對(duì)其進(jìn)行基因組序列測(cè)定與分析[5-6]。N-DHV的不斷出現(xiàn)嚴(yán)重危害養(yǎng)鴨業(yè)的發(fā)展。

本研究對(duì)從廣西、河南和山東發(fā)病鴨體內(nèi)分離的3株病毒進(jìn)行初步鑒定，確定為N-DHV。并對(duì)分離株的VP1基因進(jìn)行序列測(cè)定及相關(guān)分析，為N-DHV分子流行特點(diǎn)的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 病料樣品分別來(lái)自廣西、河南以及山東發(fā)病鴨場(chǎng)；DHV-1及DHV-1陽(yáng)性血清購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；N-DHV陽(yáng)性血清由山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院實(shí)驗(yàn)室制備，中和效價(jià)≥1∶64；SPF雞胚購(gòu)自濟(jì)南斯帕法斯家禽有限公司；鴨胚及雛鴨均購(gòu)自濱州久久鴨場(chǎng)。

1.2 主要試劑 反轉(zhuǎn)錄酶(M-MuLV)購(gòu)自北京百泰克生物技術(shù)有限公司；反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑、dNTP、rTaqDNA聚合酶、DNA Marker購(gòu)自TaKaRa公司；TRIzol購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。

1.3 樣品處理 將病料樣品按1∶5比例加入滅菌生理鹽水，勻漿搗碎，反復(fù)凍融3次，8000 r/min離心10 min，取上清液加入青霉素、鏈霉素使其終濃度均為2000 IU/mL，37℃作用30 min，以0.22 μm過(guò)濾備用。

1.4 RT-PCR檢測(cè) 參照文獻(xiàn)[7]由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成鑒定N-DHV的引物。參照TRIzol說(shuō)明書(shū)提取病毒RNA。反轉(zhuǎn)錄條件為：70℃ 5 min；42℃ 1 h；70℃ 10 min。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃ 5 min；94℃ 40 s、58℃ 40 s、72℃1 min，30個(gè)循環(huán)；72℃10 min。產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.5 病毒分離 將處理的病料樣品經(jīng)尿囊腔途徑接種11日齡鴨胚，接種量為0.2 mL/胚；同時(shí)設(shè)等量滅菌生理鹽水對(duì)照組。分別孵化，觀察鴨胚的病變和死亡情況，并收獲24 h～96 h尿囊液繼續(xù)傳代。

1.6 病毒鴨胚半數(shù)致死量(ELD50)測(cè)定 以生理鹽水將鴨胚分離病毒株作10倍系列稀釋?zhuān)∵m宜稀釋度鴨胚毒接種11日齡鴨胚，每個(gè)稀釋度接種5枚，0.2 mL/胚，37℃繼續(xù)培養(yǎng)，觀察并記錄鴨胚的死亡數(shù)目。按Reed-Muench法計(jì)算病毒ELD50。

1.7 血清中和試驗(yàn) 采用固定病毒稀釋血清法。將DHV-1和N-DHV陽(yáng)性血清(中和效價(jià)≥1∶64)分別于56℃滅活30 min，進(jìn)行10倍倍比稀釋?zhuān)魅?.5 mL分別與等量200 ELD50分離株混勻，37℃作用1 h，經(jīng)尿囊腔分別接種11日齡鴨胚，每組接種5枚，0.2 mL/胚，同時(shí)設(shè)病毒和生理鹽水對(duì)照組。37℃培養(yǎng)，觀察6 d，記錄各組的死胚數(shù)目。

1.8 動(dòng)物回歸試驗(yàn) 將病毒液稀釋為200 ELD50，頸部皮下注射無(wú)DHV母源抗體的3日齡雛鴨5只，0.3 mL/只。另設(shè)5只正常對(duì)照，隔離飼養(yǎng)觀察7 d。

1.9 SPF雞胚感染試驗(yàn) 取分離的3株病毒鴨胚尿囊液經(jīng)尿囊腔接種SPF雞胚，0.2 mL/胚，盲傳5代后收獲尿囊液。

1.10 細(xì)胞接種試驗(yàn) 將分離的3株病毒鴨胚尿囊液分別接種單層雞胚成纖維細(xì)胞，盲傳5代后取細(xì)胞培養(yǎng)液接種11日齡鴨胚，檢測(cè)病毒是否能夠在其中增殖。

1.11 VP1基因的擴(kuò)增

1.1 1.1 引物的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank中登錄的 N-DHV VP1基 因 序 列(AP-03337，DQ25613；AP-04009， DQ25613； AP-04114， DQ812093；AP-04203，DQ25613)，設(shè)計(jì)引物：F：5'-CGGATCC GGTGATTCCAATCAGCT-3'和 R：5'-CCCAAGCTTT TCAATTTCCAAATGGA-3'。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。分別含有BamHⅠ和HindⅢ酶切位點(diǎn)，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為720 bp。

1.1 1.2 分離株VP1基因的擴(kuò)增 提取分離株RNA，并進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件為：94℃5 min；94℃ 50 s、60℃ 50 s、72℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)；72℃10 min。產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并克隆至pMD18-T載體中進(jìn)行鑒定，鑒定正確的重組質(zhì)粒測(cè)序。并與GenBank中登錄的DHV參考株VP1基因進(jìn)行序列比對(duì)，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。所用病毒株及其GenBank登錄號(hào)為：DHV-A(03D，DQ249299； 5886， DQ249301； A66， DQ886445)DHV-B(90D，EF067924；04G，EF067923)和 DHV-C(AP-03337， DQ25613； AP-04009， DQ25613；AP-04114，DQ812093；AP-04203，DQ25613)。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果 采用N-DHV鑒別引物對(duì)分離株進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后可見(jiàn)約為700 bp清晰條帶，與預(yù)期片段大小(705 bp)一致(圖 1)。

2.2 鴨胚病毒分離結(jié)果 將病料樣品接種11日齡易感鴨胚，24 h～96 h死亡鴨胚肝臟出血，腫大，收獲其尿囊液繼續(xù)傳代。分離獲得3株病毒，從廣西、河南、山東分離到的病毒分別依次命名為GX株、HN株、LZ株。

2.3 病毒鴨胚ELD50分離病毒GX株、HN株、LZ株的ELD50值分別為10-3.29/0.2 mL、10-4.25/0.2 mL和10-4.65/0.2 mL。

2.4 血清中和試驗(yàn)結(jié)果 分別以DHV-1和N-DHV陽(yáng)性血清與分離株進(jìn)行交叉中和試驗(yàn)，結(jié)果表明：DHV-1陽(yáng)性血清對(duì)分離株無(wú)中和作用，接種的鴨胚在48 h～96 h全部死亡，表明分離株不是DHV-1；分離株對(duì)照組接種的鴨胚在48 h～96 h也全部死亡，而N-DHV陽(yáng)性血清對(duì)分離株具有保護(hù)作用，鴨胚僅在96 h死亡1只，因此分離株可以判定為N-DHV(表 1)。

2.5 動(dòng)物回歸試驗(yàn)結(jié)果 攻毒組雛鴨在48 h開(kāi)始發(fā)病死亡，在96 h內(nèi)GX株、HN株、LZ株的死亡率分別為50%、70%和65%，表明分離的3株病毒的毒力存在一定差異。死亡鴨呈現(xiàn)典型的DVH癥狀和病理變化，角弓反張、肝臟腫大、有出血點(diǎn)、出血斑，而對(duì)照組鴨無(wú)任何癥狀。

表1 血清中和試驗(yàn)結(jié)果Table 1 The neutralization tests of the isolates with different anti-serum

2.6 分離株接種SPF雞胚試驗(yàn) 經(jīng)SPF雞胚連續(xù)傳5代，雞胚發(fā)育正常，無(wú)死亡，再返傳鴨胚也未出現(xiàn)死亡，表明分離株不能在雞胚中增殖。

2.7 細(xì)胞接種試驗(yàn)結(jié)果 分離株接種雞胚成纖維細(xì)胞，傳至第3代時(shí)細(xì)胞出現(xiàn)病變，分離株傳代至第5代，接毒60 h后，細(xì)胞皺縮、死亡、脫落，產(chǎn)生明顯病變。將第5代細(xì)胞培養(yǎng)液接種鴨胚后，鴨胚也出現(xiàn)病變、死亡，表明分離株可以在雞胚成纖維細(xì)胞中增殖(圖2)。

2.8 分離株VP1基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果 VP1基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果表明，擴(kuò)增片段約720 bp，與預(yù)期目的片段大小一致(圖3)。

2.9 VP1基因序列分析 測(cè)序結(jié)果表明分離株GX、LZ、HN的VP1基因均為714 bp。將3個(gè)分離株的VP1基因序列與GenBank中登錄的序列進(jìn)行同源性比較，結(jié)果顯示：3個(gè)分離株核苷酸序列與DHV-A、DHV-B、DHV-C的序列同源性分別為68.1%～69.6%、70.7%～71.4%、92.4%～94.8%，氨基酸序列同源性分別為75.7%～76.6%、78.4%～79.4%、91.9%～92.8%(圖 4)。3個(gè)分離株與DHV-C的同源性最高，與DHV-A的同源性最低。與DHV-A相比，分離株的VP1基因存在連續(xù)3個(gè)氨基酸的插入和1個(gè)氨基酸的缺失；而與DHV-B相比，分離株的VP1基因存在連續(xù)3個(gè)氨基酸的插入和連續(xù)2個(gè)氨基酸的缺失。3個(gè)分離株之間的同源性為98.6%～99.5%，同源性較高，表明我國(guó)廣西、河南、山東地區(qū)均存在韓國(guó)N-DHV的流行。

2.10 遺傳進(jìn)化分析 對(duì)VP1蛋白氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，繪制遺傳進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果表明GX株、HN株和LZ株與DHV-C處于同一分支，親緣關(guān)系較近，但為不同小分支，表明我國(guó)分離的DHV-C與韓國(guó)分離的DHV-C存在一定差異性，并且與DHV-B相鄰，而與DHV-A處于明顯不同的分支(圖5)。

3 討 論

RT-PCR作為一種分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、快速等優(yōu)點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)首先采用RT-PCR技術(shù)對(duì)分離株進(jìn)行鑒定，并與DHV-1陽(yáng)性血清進(jìn)行交叉中和試驗(yàn)，結(jié)果表明DHV-1陽(yáng)性血清不能中和分離株，因此分離株不屬于DHV-1，與DHV-1無(wú)血清學(xué)相關(guān)性。動(dòng)物回歸試驗(yàn)結(jié)果表明3個(gè)分離株的死亡率不同，分離株的毒力存在一定差異。將分離株接種11日齡SPF雞胚，雞胚發(fā)育正常，再返傳鴨胚，鴨胚也發(fā)育正常，未發(fā)生死亡，表明分離株不能在雞胚中增殖，這與蘇敬良報(bào)道N-DHV不能在雞胚中增殖相一致。

目前，已有學(xué)者對(duì)N-DHV的基因組全序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)N-DHV的VP1蛋白多暴露于病毒表面，包括了大部分的插入與缺失片段和高變異區(qū)，是決定病毒抗原性的主要成分，它能夠誘導(dǎo)動(dòng)物產(chǎn)生中和抗體。VP1蛋白的差異體現(xiàn)了我國(guó)N-DHV的流行特點(diǎn)[8-11]。因此，通過(guò)對(duì)VP1蛋白的核苷酸與氨基酸序列同源性的比較，分析該高變區(qū)，這對(duì)DHV的遺傳變異的研究具有指導(dǎo)意義。本研究通過(guò)對(duì)VP1蛋白的分析，為N-DHV分子流行特點(diǎn)的進(jìn)一步研究以及該病的防制提供依據(jù)。

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