齊墩果烷三萜類化合物的抗腫瘤活性及機制研究進展

張珍珍， 趙 氚， 陳 思， 季 暉*

(1.中國藥科大學藥理學教研室，江蘇 南京 210009;2.海軍總醫(yī)院藥劑科，北京 100048)

三萜類化合物為一類基本母核由30個碳原子組成的萜類化合物，其結(jié)構(gòu)根據(jù)異戊二烯定則可視為6個異戊二烯單位聚合而成。該類化合物廣泛分布于自然界，在菌類、植物和動物中均有存在，其生物合成途徑是由鯊烯通過不同環(huán)化方式轉(zhuǎn)變而來。研究顯示，三萜類化合物具有多種生理活性，如溶血、抗腫瘤、抗炎、抗菌、抗病毒、降膽固醇及抗生育等。目前，從自然界中分離獲得的三萜類化合物已超過2萬種，其中多種化合物，如齊墩果烷型五環(huán)三萜類化合物齊墩果酸(OA，1)和烏蘇烷型五環(huán)三萜類化合物熊果酸(UA)被證實具有抗炎和抗腫瘤活性。近年來，三萜類化合物中抗腫瘤活性最強的齊墩果烷型類化合物引起了國內(nèi)外學者的普遍關(guān)注，通過對該類化合物的結(jié)構(gòu)修飾和構(gòu)效關(guān)系研究，現(xiàn)已獲得一系列活性更好的衍生物［1］，與此同時，其抗腫瘤的機制探究也在不斷深入。本文對齊墩果烷型三萜類化合物的抗腫瘤活性及其作用機制研究進展進行綜述，旨在為該類化合物作用機制的闡明及相關(guān)藥物研發(fā)提供參考。

1 齊墩果烷三萜類化合物的化學結(jié)構(gòu)及抗腫瘤活性

齊墩果酸分子結(jié)構(gòu)中有3個可供修飾的官能團——C17位羧基、C12位和C13位間的雙鍵以及C3位羥基。研究人員通過對該化合物進行改造，得到了抗腫瘤活性更強的結(jié)構(gòu)類似物，如2-氰基-3，12-二氧代齊墩果烷-1，9-二烯-28-酸(2-cyano-3，12-dioxooleana-1，9-dien-28-oic acid，CDDO，2)及其 C17位取代的一系列衍生物 CDDO-Me(3)、CDDO-Im(4)、CDDO-MA(5)、CDDO-EA(6)和 Di-CDDO(7)等。在體外，這些化合物對多種腫瘤(如乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、卵巢癌、脂肉瘤、骨肉瘤和神經(jīng)細胞瘤等實體瘤，以及白血病、淋巴瘤和骨髓瘤等非實體瘤)細胞均具有促進凋亡和增殖抑制作用［3-12］，其中，CDDO-Me 對骨肉瘤 HOB-c、KHOS、KHOSR2、U-2OS 和 U-2OSTR細胞的 IC50分別為 0.8、0.15、0.33、0.17 和 0.39 μmol·L－1［7］，對成神經(jīng)瘤 LAN1、NBEB、SKNAS、SKNDZ和SKNSH細胞株的 IC50分別為160、305、418、525 和 630 nmol·L－1［9］;CDDO 對 B 細胞淋巴瘤OCI-Ly19和OCI-Ly10細胞的IC50分別為1.25 和 2.0 μmol·L－1［10］;CDDO-Im 對耐地塞米松的骨髓瘤 MM.1R 細胞的 IC50為 0.15 μmol·L－1，CDDO-Me對耐伊馬替尼的慢性粒細胞白血病KBM5-R 細胞的 IC50為 0.22 μmol·L－1［13-14］。值得一提的是，該類化合物安全性較高，如 CDDO和CDDO-Me在誘導腫瘤細胞凋亡的濃度下，對取自急性髓系白血病患者或健康受試者的正常淋巴細胞均無明顯毒性［15］，故而極具開發(fā)為抗腫瘤藥物的潛力。

齊墩果烷型三萜類化合物的體內(nèi)抗腫瘤活性也已通過多種荷瘤動物模型得到了證實。如Liby等［16］給乙烯基氨基甲酸酯所致的肺癌模型小鼠飼以含有 CDDO-ME(60 mg·kg－1·d－1)或 CDDO-EA(400 mg·kg－1·d－1)的飼料，15 周后處死小鼠，取其肺進行觀察，結(jié)果顯示，CDDO-ME和CDDO-EA組小鼠肺表面的平均瘤體數(shù)分別為7.4和7.8個，而未給藥組小鼠肺表面平均瘤體數(shù)為15.8個，表明CDDO-ME和CDDO-EA均可顯著抑制小鼠肺部腫瘤生長;Jutooru等［17］給荷有胰腺癌L3.6pL細胞的裸鼠灌胃給予 CDDO-Me(7.5 mg·kg－1·d－1)或空白溶劑，連續(xù)給藥4周，結(jié)果，CDDO-Me組和空白溶劑對照組小鼠瘤體積分別約為500和2400 mm3，瘤重分別為1和2 g;Deeb等［18］給前列腺癌轉(zhuǎn)基因模型小鼠灌胃給予 CDDO(10 μmol·kg－1，每周第 1 ～5天給藥)，20周后，空白溶劑對照組和CDDO組中發(fā)生腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的小鼠比例分別為63%和27%。

2 齊墩果烷三萜類化合物的抗腫瘤作用機制

凋亡為細胞的內(nèi)源性死亡程序，對保持組織內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定具有重要作用，且這一特性在不同物種中均具有高度保守性。凋亡在多種正常生理過程中可起到調(diào)節(jié)作用，若此功能出現(xiàn)異?；蛉笔t可導致一系列病理情況發(fā)生。腫瘤細胞的特征之一就是缺乏這種程序性的死亡過程，提示腫瘤細胞中存在某種可避開凋亡途徑的機制。而現(xiàn)有研究表明，齊墩果烷型三萜類化合物的抗腫瘤活性與激活腫瘤細胞凋亡的線粒體途徑有關(guān)［2］。腫瘤細胞經(jīng)齊墩果烷三萜類化合物處理后，線粒體膜通透性顯著增加，其內(nèi)部多種促凋亡物質(zhì)如細胞色素C或AIF隨之大量釋放，從而啟動下游反應，誘導細胞凋亡。

2.1 細胞凋亡的線粒體途徑

凋亡是細胞生理性死亡的普遍形式，該過程受到一系列信號通路的調(diào)節(jié)，其中線粒體途徑起著至關(guān)重要的作用。線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(mitochondrial permeability transition pore，MPTP)是線粒體內(nèi)外信息交流的樞紐，其開放后可導致線粒體許多功能發(fā)生致命性變化，從而啟動凋亡途徑。MPTP位于線粒體內(nèi)外膜之間，主要由外膜的電壓依賴性陰離子通道(voltage dependent anion channel，VDAC)、內(nèi)膜的腺苷酸轉(zhuǎn)移酶(adenine nucleotide translocator，ANT)、基質(zhì)中的親環(huán)蛋白D(cyclophilin D)及其他蛋白(如外周苯二氮受體、己糖激酶和肌酸激酶等)組成［19］。MPTP在正常生理條件下處于關(guān)閉狀態(tài);在應激狀態(tài)下則開放通道，并允許相對分子質(zhì)量小于1500的物質(zhì)通過，進而使線粒體基質(zhì)滲透壓升高。隨著MPTP的開放，線粒體內(nèi)外H+梯度消失，線粒體膜電位降低，呼吸鏈解偶聯(lián)，無法產(chǎn)生能量，此時解偶聯(lián)的呼吸鏈會產(chǎn)生大量活性氧簇(ROS)，氧化線粒體內(nèi)膜上的還原型心肌磷脂，使線粒體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性大大降低。由于水和溶質(zhì)大量涌入，線粒體發(fā)生腫脹，外膜破裂，一系列促凋亡物質(zhì)如細胞色素C、第二線粒體源性Caspase激活因子(second mitochondria-derived activator of Caspase，Smac，也稱DIABLO)和凋亡誘導因子(AIF)從中釋放。細胞色素C釋放到細胞質(zhì)后與凋亡蛋白酶激活因子(Apaf-1)結(jié)合，使得Apaf-1與dATP的親和力增加，進而促進Apaf-1構(gòu)象變化并不斷招募Procaspase-9，細胞色素 C、dATP、Apaf-1 和 Procaspase-9形成聚合體即凋亡復合體(apoptosome)。凋亡復合體促進其招募的大量Procaspase-9發(fā)生剪切反應，形成活化的Caspase-9，后者可作為剪切因子使Procaspase-3活化為Caspase-3。Caspase-3是執(zhí)行凋亡的關(guān)鍵蛋白，可進一步激活下游級聯(lián)反應，最終導致細胞凋亡。Smac蛋白釋放至胞質(zhì)后，可與凋亡抑制蛋白(IAP)特異性結(jié)合，解除IAP對Caspase-9和Caspase-3的阻遏作用，從而激活各級Caspase引起級聯(lián)反應;而AIF和內(nèi)切核酸酶G(Endo G)可轉(zhuǎn)位進入胞核，不依賴于Caspase途徑直接引起染色質(zhì)濃縮及DNA斷裂［20］。目前，已知可直接或間接參與 MPTP調(diào)控的內(nèi)源性物質(zhì)有 Bcl-2家族蛋白、Ca2+、ROS、ATP和ADP等。隨著研究的不斷深入，研究人員發(fā)現(xiàn)砷化物、蒼術(shù)苷、二酰胺以及齊墩果烷三萜類化合物等物質(zhì)均可刺激MPTP開放，而環(huán)孢素A(CsA)可抑制MPTP開放。細胞凋亡的線粒體途徑基本原理如圖1所示。

圖1 細胞凋亡的線粒體途徑示意圖Figure 1 Schematic diagram of mitochondrial pathway of apoptosis

2.2 齊墩果烷三萜類化合物對腫瘤細胞凋亡線粒體途徑的作用

2.2.1 增大線粒體膜通透性 線粒體凋亡途徑的激活通常以線粒體膜通透性增大為起點。值得一提的是，齊墩果烷三萜類化合物激活線粒體膜通透性增加的機制不同于內(nèi)源性物質(zhì)，如Brookes等［2］發(fā)現(xiàn) CDDO(2.5 μmol·L－1)能夠誘導 B 細胞淋巴瘤OCI-Ly19細胞凋亡，凋亡率為80%;將 CDDO(2.5 μmol·L－1)、CsA(1μmol·L－1)與 OCI-Ly19 細胞共孵育后，細胞凋亡率仍為80%左右。為進一步考察化合物對線粒體結(jié)構(gòu)和功能的影響，他們將大鼠肝細胞破碎后，通過密度梯度離心獲得線粒體，然后分別用 Ca2+、Ca2++CDDO、Ca2++CDDO-Im 和Ca2++DI-CDDO(CDDO、CDDO-Im和 DI-CDDO終濃度為1或5 μmol·L－1)進行處理，發(fā)現(xiàn)上述各組MPTP均開放;其中，Ca2+組以及Ca2++低濃度藥物組線粒體發(fā)生的通透性增大現(xiàn)象可被CsA抑制，而Ca2++高濃度藥物組無法被抑制，提示齊墩果烷三萜類化合物與Ca2+均可激活MPTP開放但兩者機制不同。此外，在完整OCI-Ly19細胞中進行的研究也獲得了相同結(jié)果。已知Ca2+可破壞線粒體呼吸鏈酶復合物Ⅰ，影響ATP合成，增加細胞毒性自由基的釋放，最終激活MPTP，該過程可被CsA抑制。

齊墩果烷三萜類化合物主要通過以下兩個機制提高線粒體膜通透性，進而促進凋亡的發(fā)生。

1)降低線粒體中還原型谷胱甘肽水平 還原型谷胱甘肽(GSH)是細胞內(nèi)重要的抗氧化劑，可清除線粒體新陳代謝和凋亡過程中產(chǎn)生的ROS，以避免ROS對線粒體內(nèi)膜的破壞，對于線粒體穩(wěn)態(tài)的維持具有重要意義。然而，線粒體自身不能合成GSH，只能利用從細胞質(zhì)中轉(zhuǎn)運進來的GSH。GSH的氧化產(chǎn)物——氧化型谷胱甘肽(GSSG)可在谷胱甘肽還原酶與NADPH的共同作用下轉(zhuǎn)變?yōu)镚SH。GSH與GSSG含量比值反映了細胞內(nèi)的氧化水平，當該比值顯著下降時，提示細胞可能已進入凋亡階段。Chernyak等(Biosci Rep，1997年)研究發(fā)現(xiàn)，GSH可保持MPTP中巰基的還原態(tài)，從而使MPTP處于關(guān)閉狀態(tài)。為了探究齊墩果烷三萜類化合物誘導線粒體內(nèi)膜通透性增強的分子機制，Samudio等［21］發(fā)現(xiàn)，將 CDDO-Im(1 μmol·L－1)與胰腺癌 COLO357細胞孵育20～120 min后，COLO357細胞線粒體GSH水平降低，細胞總GSH水平無顯著變化，ROS聚集增強，線粒體膜電位下降，提示CDDO-Im有可能通過降低線粒體GSH開放MPTP孔道，從而使線粒體膜通透性增強。2-巰基乙醇(BME)可逆轉(zhuǎn)CDDO-Im的這種作用，有趣的是，其僅能徹底清除由CDDO-Im誘導產(chǎn)生的ROS，而不能清除由過氧化氫誘導產(chǎn)生的ROS，提示CDDO-Im引起線粒體GSH流失是導致ROS聚集增強的直接原因，BME并不能直接清除ROS，而是通過阻止由CDDO-Im引起的線粒體GSH流失來下調(diào)ROS水平。

心肌磷脂為線粒體磷脂的重要組成部分，對線粒體內(nèi)膜穩(wěn)定性的維持有著重要作用。Samudio等［22］發(fā)現(xiàn)，CDDO-Me可使人白血病U937細胞線粒體內(nèi)膜中的還原型心肌磷脂含量大幅度降低，進而使線粒體膜電位下降，且這一過程不可被Caspase廣譜抑制劑z-VAD-fmk逆轉(zhuǎn);而星形孢菌素、紫外線和腫瘤壞死因子等誘導的線粒體膜電位下降及細胞凋亡均依賴于Caspase途徑，因此，上述結(jié)果提示CDDO-Me能不依賴于Caspase途徑作用于線粒體內(nèi)膜中的心肌磷脂，使線粒體內(nèi)膜通透性增大。在慢性粒細胞白血病KBM5細胞及KBM5R細胞中進行的研究結(jié)果亦表明:CDDO-Me能使線粒體內(nèi)膜中的還原型心肌磷脂含量減少，其原因是CDDO-Me選擇性降低了線粒體GSH水平，使氧化應激反應蛋白——血紅素加氧酶1(HO-1)表達水平升高，導致ROS增多，從而引起還原型心肌磷脂被氧化，線粒體穩(wěn)定性下降，膜通透性增大［14］。

2)動員凋亡蛋白Bax的遷移 細胞色素C對于生命活動的重要性不僅體現(xiàn)在其參與細胞能量的生成，且在凋亡中也發(fā)揮著重要作用。大量研究表明細胞色素C與Apaf-1的結(jié)合是凋亡進程中的關(guān)鍵步驟［23-24］。關(guān)于細胞色素C釋放的具體機制，目前主要存在2種假說。一是與MPTP的開放有關(guān):當MPTP被激活時，線粒體膜發(fā)生破裂，從而釋放細胞色素C［25］;二是與 Bcl-2蛋白家族的參與有關(guān):Bcl-2蛋白家族屬于信號轉(zhuǎn)導蛋白，可參與線粒體外膜通透性的調(diào)節(jié)。該家族包括抗凋亡蛋白(如Bcl-2、Bcl-xL、Bcl-w 和 Mcl-1)與促凋亡蛋白(如 Bax、Bak及Bok)，Bcl-2定位于MPTP，可抑制MPTP的開放，當各種刺激因子作用于細胞時，Bax從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至線粒體外膜并發(fā)生聚集，在線粒體外膜磷脂層中形成孔道，這些孔道可使小分子蛋白如細胞色素C 通過［26］。Konopleva 等［27］發(fā)現(xiàn)，CDDO-Me 能增加人白血病HL-60和U937細胞中bax mRNA水平，進而使Bax表達增多，且線粒體中Bax水平上升，細胞質(zhì)中Bax水平下降，表明CDDO-Me能誘導Bax從胞質(zhì)向線粒體遷移。此外，齊墩果烷三萜類化合物也能誘導非小細胞肺癌H460和A549細胞和卵巢癌A2780細胞中Bax表達增多，進而促進線粒體釋放細胞色素 C［28-29］。Samudio 等［22］發(fā)現(xiàn)，在 CDDO-Me誘導U937細胞發(fā)生凋亡的過程中，細胞色素C達到最大釋放量時可見大量Bax發(fā)生轉(zhuǎn)運，然而Bax轉(zhuǎn)運至線粒體之前，細胞色素C就已開始從線粒體中釋放，由此推測，Bax轉(zhuǎn)運在齊墩果烷三萜類化合物促腫瘤細胞凋亡過程中發(fā)揮了重要作用，但并非促使細胞色素C釋放的唯一原因，即細胞色素C的釋放可能存在多種機制。

2.2.2 促進凋亡誘導因子釋放 AIF為線粒體蛋白中的一種，在凋亡過程中也能從線粒體膜間隙釋放至胞質(zhì)中，且該過程不依賴于Caspase。AIF前體蛋白可通過其N末端的線粒體定位信號穿入線粒體內(nèi)外膜間隙，然后被線粒體內(nèi)肽酶加工為成熟的蛋白分子，此時分子N末端錨定于線粒體內(nèi)膜。當AIF與一些細胞凋亡因子發(fā)生作用后，可從線粒體膜上的錨定位點脫離;隨著線粒體外膜通透性增加，該分子可從線粒體膜間隙中釋放至胞質(zhì)中，然后通過分子自身攜帶的核定位信號轉(zhuǎn)運至細胞核內(nèi)，從而激活核酸內(nèi)切酶，對細胞核內(nèi)DNA進行水解，造成大范圍的DNA片段化及染色質(zhì)凝集［30］。研究顯示，CDDO和CDDO-Im可促使A2780和U937細胞線粒體內(nèi)的 AIF濃度下降，細胞核 AIF濃度上升［21，29］。Konopleva 等［31］通過免疫熒光技術(shù)觀察到在未經(jīng)藥物處理的U937細胞中，AIF呈散點狀分布于細胞質(zhì)中，而經(jīng)CDDO處理后，AIF則主要聚集于細胞核中。由此推測，齊墩果烷三萜類化合物能促使AIF大量釋放，從很大程度上說是MPTP被激活的結(jié)果。

AIF信號通路并非存在于所有形式的細胞凋亡中，但在某些細胞的凋亡中的作用尤為關(guān)鍵［32］。AIF從線粒體中釋放往往早于細胞色素C，若用抗體封閉AIF或敲除AIF基因均可使受試細胞免于死亡，且線粒體不再釋放細胞色素 C。Konopleva等［31］采用siRNA技術(shù)沉默U937細胞中的AIF基因，使AIF表達水平下調(diào)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CDDO對U937細胞的抑制率顯著降低，胞內(nèi)DNA片段化程度也明顯減小。上述研究表明:齊墩果烷三萜類化合物激活U937細胞MPTP開放后觸發(fā)的一系列下游反應中，AIF介導的凋亡通路發(fā)揮了至關(guān)重要的作用。

但是，MPTP開放并非促進AIF釋放的唯一原因，多聚ADP核糖聚合酶1(PARP-1)也可促進線粒體釋放AIF。線粒體中多種信號通路如AIF和細胞色素C各自誘導的凋亡通路雖然互不依賴，但也并非完全相互獨立——AIF可促使線粒體釋放更多的細胞色素C，細胞色素C活化的Caspase亦可促進線粒體釋放AIF。因此，齊墩果烷三萜類化合物也有可能通過激活其他信號通路促進AIF釋放。

2.3 齊墩果烷三萜類化合物對其他細胞凋亡途徑的作用

現(xiàn)有研究表明:除作用于線粒體途徑外，齊墩果烷三萜類化合物還能調(diào)節(jié)腫瘤細胞凋亡中的其他信號通路，例如，CDDO可通過直接作用于過氧化物酶體增殖物活化受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPARγ)激活 Caspase 8 和 Caspase3，最終誘導腫瘤細胞凋亡［33］;核轉(zhuǎn)錄因子 κB(NF-κB)可調(diào)節(jié)細胞的增殖和分化，尤其在腫瘤細胞的抗凋亡機制中發(fā)揮著重要作用，Shishodia等［34］發(fā)現(xiàn)CDDO-Me可抑制KBM5細胞中NF-κB通路中的關(guān)鍵激酶——NF-κB 抑制物(IκB)激酶(IKK)，進而阻斷NF-κB通路，誘導細胞凋亡;Janus激酶－信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄激活因子(Jak-STAT)信號轉(zhuǎn)導途徑參與細胞的增殖、分化、凋亡及免疫調(diào)節(jié)等過程，Duan等［35］發(fā)現(xiàn) CDDO-Me能抑制耐紫杉醇的卵巢癌OVCAR8TR細胞中的酪氨酸蛋白激酶——Jak2激酶和Scr激酶，進而抑制下游STAT3的磷酸化及核轉(zhuǎn)運，導致受STAT3調(diào)節(jié)的相關(guān)抗凋亡蛋白(如BclxL)水平下降，從而誘導細胞凋亡;Deeb等［36］發(fā)現(xiàn)CDDO-Me可通過抑制胰腺癌PC-3細胞中的抗凋亡通路——絲氨酸/蘇氨酸激酶［AKT，也稱為蛋白激酶B(PKB)］通路和哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)通路誘導細胞凋亡。Liby等［37］推測齊墩果烷三萜類化合物母核的C1和C9充當了邁克爾加成反應的電子受體，易被包括巰基在內(nèi)的電子供體進攻，PPARγ和IKK等蛋白質(zhì)的活性中心均含有半胱氨酸，故而可與齊墩果烷三萜類化合物形成加合物，從而觸發(fā)下游促凋亡反應。

3 結(jié)語

目前，對齊墩果烷三萜類化合物誘導腫瘤細胞凋亡的分子機制的研究還在進行中，有關(guān)文獻報道不斷問世，但最終定論尚未闡明。

中國藥科大學新藥研究中心 Ding等［38］曾對CDDO進行內(nèi)酯化，合成了一系列結(jié)構(gòu)新穎的2-氰基-3，12-二氧代齊墩果烷-1，9-二烯-28，13β-內(nèi)酯化合物。筆者所在課題組對此類化合物進行了抗腫瘤活性初篩，并初步探討了其可能的作用機制。初步研究結(jié)果表明:其中化合物8對肝癌細胞HepG2 的抑制活性最強，IC50為 1.86 μmol·L－1。初步機制研究結(jié)果顯示，HepG2細胞經(jīng)該化合物處理后，線粒體膜電位降低，細胞抗氧化能力減弱，線粒體中c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)信號通路和p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)信號通路被激活，進而使Bax與Bcl-2比值升高，促發(fā)細胞色素C和AIF的釋放。今后還將進一步研究該類化合物誘導腫瘤細胞凋亡的機制及其體內(nèi)抗腫瘤作用，以期為相關(guān)藥物的開發(fā)提供依據(jù)。

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