HPLC梯度洗脫法同時(shí)測(cè)定復(fù)方鹽酸喹那普利/氫氯噻嗪片劑含量及有關(guān)物質(zhì)

呂靈云， 操 鋒， 肖衍宇， 平其能

(中國(guó)藥科大學(xué)藥劑學(xué)教研室，江蘇 南京 210009)

復(fù)方鹽酸喹那普利/氫氯噻嗪片劑(商品名:Accuretic)是輝瑞公司于1999年上市的高血壓和充血性心力衰竭治療藥物，主要成分是鹽酸喹那普利和氫氯噻嗪。其中，鹽酸喹那普利(QHCl)為無(wú)巰基、長(zhǎng)效、口服血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(ACEI)，是第3代ACEI的優(yōu)秀代表之一［1］;氫氯噻嗪(HCTZ)是臨床常用利尿藥，常與其他降壓藥合用治療高血壓。HCTZ和QHCl合用，可增強(qiáng)ACEI的作用。

與其他ACEI類藥物一樣，QHCl存在穩(wěn)定性問(wèn)題，其降解途徑為:1)分子內(nèi)仲胺去質(zhì)子化后進(jìn)攻羰基成環(huán)，形成2，5-二酮哌嗪(DKP);2)側(cè)鏈酯基水解形成喹那普利拉。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，QHCl對(duì)濕度、pH和溫度敏感，其環(huán)化和水解均與環(huán)境pH有關(guān)，即在低pH條件下，主要生成DKP;在較高pH條件下，主要生成喹那普利拉［2-5］。HCTZ的有關(guān)物質(zhì)4-氨基-6-氯-1，3-苯二磺酰胺(以下簡(jiǎn)稱二磺酰胺)既是HCTZ合成過(guò)程的中間體，也是其降解產(chǎn)物［6］。

美國(guó)藥典32版(USP32)推薦采用HPLC法同時(shí)測(cè)定QHCl及其兩個(gè)有關(guān)物質(zhì)，也有文獻(xiàn)報(bào)道采用HPLC法測(cè)定QHCl或同時(shí)檢測(cè)QHCl和喹那普利拉［7-8］。中國(guó)藥典2010年版二部則規(guī)定分別采用非水滴定法及紫外分光光度法測(cè)定HCTZ原料及制劑含量，而采用比色法進(jìn)行有關(guān)物質(zhì)二磺酰胺限度檢查，還有文獻(xiàn)采用HPLC法測(cè)定HCTZ及其有關(guān)物質(zhì)［9］。Gandhimathi等［10］報(bào)道采用 HPLC 法同時(shí)測(cè)定復(fù)方QHCl/HCTZ片劑中兩個(gè)主要成分的含量，另有報(bào)道用LC-MS法同時(shí)測(cè)定人血漿中HCTZ、QHCl和喹那普利拉［11］。目前國(guó)內(nèi)外尚未見有同時(shí)檢測(cè)復(fù)方QHCl/HCTZ片劑中QHCl、喹那普利拉、DKP、HCTZ及二磺酰胺等5種化合物的報(bào)道，本文采用HPLC梯度洗脫法實(shí)現(xiàn)了這5種化合物的良好分離和測(cè)定，為該復(fù)方片劑的質(zhì)量控制提供了一種有效的分析方法。

1 儀器與試藥

Agilent 8453紫外掃描儀;Agilent 1100型高效液相色譜儀，包括G1312A型二元泵、G1313A型自動(dòng)進(jìn)樣器、G1314A型紫外檢測(cè)器和AT-103柱溫箱;BS124S型電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司);KQ-100型臺(tái)式超聲儀(昆山市超聲儀器有限公司);PB-10型pH計(jì)(Sartorius公司)。

HCTZ對(duì)照品(純度99.8%，中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)100309-200702，用前于105℃烘箱中放置4 h);QHCl對(duì)照品(純度98.3%，中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)100568-200401);復(fù)方QHCl/HCTZ片劑樣品(自制，規(guī)格:10.8/12.5 mg，批號(hào):20110405、20110406、20110408);水為純凈水，乙腈為色譜純，三乙胺和磷酸為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱:Lichrospher C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);流動(dòng)相A:0.05%三乙胺水溶液(用10%磷酸調(diào)pH至3.50)，流動(dòng)相B:乙腈，按表1中程序進(jìn)行線性梯度洗脫;柱溫:40℃;檢測(cè)波長(zhǎng):215 nm;進(jìn)樣量:20 μL。在該色譜條件下，5種化合物的相鄰各峰間分離度均大于1.5;理論塔板數(shù)按QHCl峰計(jì)算大于20000，按HCTZ峰計(jì)算大于4000。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Procedure of gradient elution

2.2 對(duì)照品溶液配制

QHCl對(duì)照品溶液:取QHCl對(duì)照品6 mg，精密稱定，置250 mL容量瓶中，加水，超聲波處理使溶解，定容至刻度，搖勻，即得。

HCTZ對(duì)照品溶液:取 HCTZ對(duì)照品12.5 mg，精密稱定，置500 mL容量瓶中，加水，超聲波處理使溶解，定容至刻度，搖勻，即得。

2.3 供試品溶液配制

取樣品10片，研細(xì)，取適量(約相當(dāng)于 QHCl 10.8 mg，HCTZ 12.5 mg)，精密稱定，置 100 mL 容量瓶中，加水適量，超聲波處理20 min，放冷，定容至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液作為貯備液;精密吸取貯備液2.0 mL至10 mL容量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.4 方法專屬性考察

按處方比例稱取空白輔料，置100 mL容量瓶中，加水適量，超聲波處理15 min，放冷，定容至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液和空白溶劑水進(jìn)樣，記錄色譜圖(見圖1A)。

稱取QHCl對(duì)照品適量，于60℃烘箱中放置10 d，用水配制成30 mg·L-1溶液，進(jìn)樣，記錄色譜圖(見圖1B)。稱取QHCl對(duì)照品適量，用水配制成50 mg·L-1溶液50 mL，共3份;取2份分別加入濃度均為0.1 mol·L-1的鹽酸和氫氧化鈉1 mL，室溫放置24 h，再分別加入同濃度氫氧化鈉及鹽酸中和;另取1份于(4500±500)lx光照度下放置24 h。稱取QHCl對(duì)照品適量，用3%雙氧水配制成50 mg·L-1溶液，室溫放置24 h。取以上分別經(jīng)酸、堿、光照、氧化處理的QHCl對(duì)照品溶液，加水稀釋1倍，進(jìn)樣，記錄色譜圖(見圖1B～C)。

HCTZ對(duì)照品的酸、堿、光照、氧化及高溫破壞實(shí)驗(yàn)同上操作，色譜圖見圖1D。

圖1 方法專屬性實(shí)驗(yàn)色譜圖Figure 1 Chromatograms of specificity test

由圖1可見，輔料對(duì)樣品測(cè)定無(wú)干擾;QHCl與其酸、堿、光照、氧化及高溫降解產(chǎn)物均能很好分離，其中酸、堿對(duì)QHCl的破壞作用明顯，降解產(chǎn)物明顯增多;HCTZ經(jīng)破壞試驗(yàn)產(chǎn)生的降解產(chǎn)物仍主要為二磺酰胺，與HCTZ分離良好，未檢測(cè)到其他降解產(chǎn)物。

2.5 線性關(guān)系考察

取QHCl對(duì)照品17.7 mg，精密稱定，置250 mL容量瓶中，用水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得QHCl貯備液(70.8 mg·L-1);另取HCTZ對(duì)照品37.9 mg，精密稱定，置500 mL容量瓶中，用水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得HCTZ貯備液(75.8 mg·L-1)。精密量取 QHCl貯備液 0.1、1、3、5、7、9 mL 各置編號(hào)為1、2、3、4、5、6 的 10 mL 容量瓶中，再精密量取HCTZ 貯備液 9、7、5、3、1、0.1 mL 依次加入上述編號(hào)為1～6的各容量瓶中，用水定容至刻度，搖勻，制得QHCl和HCTZ的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)樣，記錄色譜圖。以峰面積(A)對(duì)質(zhì)量濃度(C)進(jìn)行線性回歸，分別得 QHCl回歸方程:A=24.785C-6.376，r=0.9998;HCTZ回歸方程:A=94.291C+28.761，r=0.9999。結(jié)果表明，QHCl和 HCTZ分別在0.708 ～63.72 mg·L-1和0.758 ～68.22 mg·L-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.6 精密度實(shí)驗(yàn)

分別取“2.5”項(xiàng)下制備的編號(hào)分別為1、3、6號(hào)的低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，于日內(nèi)每隔2 h進(jìn)樣測(cè)定1次，連續(xù)5次;另于每日進(jìn)樣測(cè)定1次(當(dāng)天配制)，連續(xù)5次，記錄色譜圖。結(jié)果顯示，3個(gè)質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液所測(cè) QHCl和HCTZ峰面積的日內(nèi)及日間RSD均在0.7%～2.1%范圍內(nèi)(n=5)，說(shuō)明方法精密度良好。

2.7 回收率實(shí)驗(yàn)

精密稱取HCTZ 對(duì)照品10、12.5、15 mg，分別置500 mL容量瓶中，加入水，超聲波處理至充分溶解，冷卻，定容，制得 19.80、25.20、30.40 mg·L-1的低、中、高質(zhì)量濃度HCTZ溶液;再精密稱取QHCl對(duì)照品 8.68、10.85、13.02 mg，分別置 500 mL 容量瓶中，加入水，超聲波處理至充分溶解，冷卻，定容，制得 17.40、21.60、25.80 mg·L-1的低、中、高質(zhì)量濃度QHCl溶液。按處方比例稱取輔料置100 mL容量瓶中，共9份，將以上低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度的HCTZ和QHCl對(duì)照品溶液分別加入含輔料容量瓶中，每個(gè)質(zhì)量濃度各3份，超聲波處理15 min，用相應(yīng)對(duì)照品溶液定容，混勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液進(jìn)樣，記錄色譜圖。將峰面積代入回歸方程，計(jì)算回收率(見表2、3)。

由表2、3可見，QHCl和HCTZ的平均回收率均在98% ～102%之間，RSD均小于2%。

2.8 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，室溫放置，分別于0、2、4、6、8 h 進(jìn)樣，記錄色譜圖。結(jié)果顯示，在不同時(shí)間點(diǎn)所測(cè)QHCl和HCTZ峰面積的RSD分別為1.66%和0.96%，表明供試品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

表2 HCTZ回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=3)Table 2 Results of HCTZ recovery test

表3 QHCl回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=3)Table 3 Results of QHCl recovery test

2.9 樣品測(cè)定

分別按“2.2”及“2.3”項(xiàng)下方法制備 QHCl和HCTZ對(duì)照品溶液及3批次樣品的供試品溶液，進(jìn)樣，記錄色譜圖。按外標(biāo)法測(cè)定樣品中兩主成分含量(以百分標(biāo)示量計(jì))，采用主成分1%自身對(duì)照法測(cè)定有關(guān)物質(zhì)(供試品溶液稀釋100倍后的色譜圖見圖2)，每批次樣品測(cè)定3次，結(jié)果見表4。

圖2 稀釋100倍的供試品溶液色譜圖Figure 2 Chromatogram of 100-fold diluted sample solution

表4 樣品測(cè)定結(jié)果(n=3)Table 4 Determining results of samples

3 討論

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

按“2.2”項(xiàng)下方法分別配制QHCl和HCTZ對(duì)照品溶液，并稀釋1倍，以水為空白溶劑，在200～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描，結(jié)果顯示，HCTZ在214、271和317 nm處有吸收峰，QHCl在215 nm處有末端吸收。故選擇兩藥均有較大吸收的波長(zhǎng)215 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.2 有關(guān)物質(zhì)的確定

USP32中明確指出，QHCl有兩個(gè)相關(guān)物質(zhì)，即喹那普利拉和DKP。且QHCl的降解行為與介質(zhì)pH密切相關(guān)，即在高pH條件下，QHCl主要降解為喹那普利拉，而在低pH條件下，QHCl主要降解為DKP。由這兩個(gè)有關(guān)物質(zhì)的結(jié)構(gòu)可知，喹那普利拉的極性大于DKP。本文中QHCl破壞性實(shí)驗(yàn)也顯示，在堿破壞實(shí)驗(yàn)色譜圖中，5.7 min處有一個(gè)明顯的有關(guān)物質(zhì)峰，而在酸破壞實(shí)驗(yàn)色譜圖中，12.5 min處則出現(xiàn)另一個(gè)明顯的有關(guān)物質(zhì)峰，且在QHCl破壞性實(shí)驗(yàn)色譜圖中未發(fā)現(xiàn)其他有關(guān)物質(zhì)峰。據(jù)此推定，色譜圖中5.7和12.5 min處的有關(guān)物質(zhì)峰應(yīng)分別出自喹那普利拉和DKP，且極性較大的喹那普利拉先出峰，DKP最后出峰，這與文獻(xiàn)［4］報(bào)道相一致。

由HCTZ破壞性實(shí)驗(yàn)色譜圖可見，在3.8 min處均只有一個(gè)相關(guān)物質(zhì)峰，無(wú)其他相關(guān)物質(zhì)峰，且在酸、堿破壞實(shí)驗(yàn)色譜圖中該峰更為明顯。此外，在相同色譜條件下，對(duì)相同質(zhì)量濃度的HCTZ對(duì)照品溶液進(jìn)樣分析，也發(fā)現(xiàn)在3.8 min處出峰。據(jù)此推定，色譜圖中3.8 min處的有關(guān)物質(zhì)峰即為二磺酰胺峰。

3.3 流動(dòng)相的選擇

在預(yù)實(shí)驗(yàn)中，曾選擇不同的流動(dòng)相系統(tǒng)對(duì)復(fù)方QHCl/HCTZ片劑進(jìn)行色譜分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與甲醇相比，乙腈用作流動(dòng)相可致色譜基線平穩(wěn)，洗脫力強(qiáng)，主成分峰形對(duì)稱性好，理論塔板數(shù)高;在反相HPLC系統(tǒng)中，由于HCTZ和二磺酰胺的極性較強(qiáng)，保留時(shí)間短，不易分開，而QHCl與DKP的極性弱，出峰較遲，因此，流動(dòng)相中乙腈的比例直接影響到HCTZ與二磺酰胺的分離度，也影響到QHCl與DKP的出峰時(shí)間;而且，采用HPLC等度洗脫法，雖然可將5種化合物較好分離，但由于化合物間極性差異大，導(dǎo)致分析時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。所以，本文采用乙腈-水梯度洗脫方式對(duì)該復(fù)方片劑進(jìn)行HPLC分析，即在HCTZ與二磺酰胺分離后，調(diào)整流動(dòng)相中乙腈比例，提高流速，致使QHCl及其有關(guān)物質(zhì)較快出峰，這樣，既使5種化合物得到很好分離，又縮短了分析時(shí)間。

3.4 流動(dòng)相pH的選擇

在色譜分析時(shí)，QHCl及其兩種有關(guān)物質(zhì)的出峰時(shí)間對(duì)流動(dòng)相pH敏感，尤其是喹那普利拉，即隨著流動(dòng)相pH值的增加，三者的出峰時(shí)間均會(huì)提前，若pH值過(guò)高，則喹那普利拉與HCTZ將無(wú)法分開，而若pH值減小，三者的出峰時(shí)間則會(huì)延遲。綜合考慮5種化合物的有效分離、分析時(shí)間及一般常用C18柱的pH適用范圍，最終選定流動(dòng)相pH為3.50。

3.5 梯度峰分析

由圖1A可見，空白輔料和溶劑進(jìn)樣后，均出現(xiàn)梯度峰。究其原因，推測(cè)可能是由于流動(dòng)相中乙腈的弱極性雜質(zhì)所致，即梯度洗脫開始時(shí)，流動(dòng)相極性較強(qiáng)，此雜質(zhì)不能被洗脫，并在柱頭富集，而隨著流動(dòng)相中有機(jī)相比例提高，其極性降低，雜質(zhì)被洗脫，故在分析后期出現(xiàn)梯度峰。

綜上所述，本文所建立的HPLC梯度洗脫法簡(jiǎn)便快速、專屬性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好，可用于復(fù)方QHCl/HCTZ片劑的含量測(cè)定和雜質(zhì)檢查。

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