血管抑素基因聯(lián)合32 P-膠體治療大鼠肝癌的療效

馬 鐸 于 峰 高慧棋 孟 昕 楊志杰 李 勇

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院PET-CT室,黑龍江 哈爾濱 150001)

由于肝癌的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移的前提是腫瘤血管的形成,所以采用抗腫瘤血管生成的基因治療可以取得良好的治療效果。目前,在基因治療方面國外學(xué)者們已取得共識,即盡可能的聯(lián)合多種基因、多種治療手段,以期發(fā)揮更大、更確切的抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移效果〔1,2〕。為此,本研究擬采用血管抑素基因聯(lián)合放射性藥物32P-膠體灌注于大鼠肝癌的局部,并觀察其治療效果,分析治療機(jī)制,以期為臨床上廣泛應(yīng)用基因治療提供有力的理論和實(shí)踐支持。

1 材料與方法

1.1 試劑及器材 總RNA提取試劑盒(Gibco-BRL公司),TUNEL熒光試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司),FV500 Olympus激光共聚焦顯微鏡(日本),CT機(jī)為 GE公司的雙排螺旋CT機(jī)。放射性32P-膠體購自北京原子高科有限公司。

1.2 方法

1.2.1 血管抑素基因重組質(zhì)粒的構(gòu)建 用Trizol試劑盒提取總RNA。血管抑素基因上游引物為5′-CGAAGCTTGGATCCATGGACCATAAGGAAGTAA-3′,下游引物 5′-TTATGAGCACCGCTTCAGGTTGCAGTAT-3′。按照常規(guī)方法進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增后的產(chǎn)物連接入pMD18T克隆載體,構(gòu)建血管抑素的重組質(zhì)粒,測序鑒定正確后擴(kuò)增并提取質(zhì)粒。

1.2.2 肝癌動(dòng)物模型的制備及分組治療 雄性Wistar大鼠,體質(zhì)量為140～150 g,購自吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。將0.05 ml Walker-256腫瘤細(xì)胞(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥理研究所提供)接種肝葉,建立肝癌動(dòng)物模型。7 d后測量腫瘤大小。大鼠分為三組:血管抑素基因治療(治療)組,血管抑素基因 +32P-膠體聯(lián)合治療(聯(lián)合)組,空白對照(對照)組,每組均為20只。大鼠開腹暴露肝臟及其腫瘤,在腫瘤局部分3個(gè)位點(diǎn)注射0.2 ml藥液:血管抑素基因質(zhì)粒 (20 μ g)〔3〕及血管抑素基因質(zhì)粒和32P-膠體混合物,對照組于瘤內(nèi)注射等體積的0.9%氯化鈉0.2 ml。

1.2.3 肝癌內(nèi)目的基因mRNA表達(dá) 基因治療肝癌3 d后,每組隨機(jī)選取3只大鼠,分離瘤組織,提取腫瘤總 RNA,采用按cDNA序列設(shè)計(jì)合成的引物,按照常規(guī)方法進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.2.4 療效觀察 ①在治療后不同時(shí)間測量腫瘤體積(Vt),與治療前腫瘤體積(V0)的比值為腫瘤生長率,用f表示(f=Vt/V0)。比較第7、14、21天各組間腫瘤生長率。②治療21 d后,處死各組大鼠,取腫瘤部位組織,用10%甲醛溶液固定,石蠟包埋,切片,進(jìn)行光鏡檢查。免疫組化測定腫瘤微血管密度(MVD):先在40倍顯微鏡下選擇癌灶內(nèi)微血管最密集的5個(gè)區(qū)域,然后在200倍鏡下計(jì)數(shù)每個(gè)區(qū)域中的血管數(shù),取5個(gè)區(qū)域的平均數(shù)作為該只大鼠腫瘤的MVD值;染色為棕色的血管內(nèi)皮細(xì)胞或血管內(nèi)皮細(xì)胞簇、血管腔和紅細(xì)胞不作為判斷微血管的標(biāo)準(zhǔn)〔3〕。③細(xì)胞凋亡指數(shù)(apoptotic index,AI)的測定:采用TUNEL方法。光鏡下觀察,每張切片隨機(jī)選取20個(gè)高倍(×400)視野,計(jì)數(shù)細(xì)胞,計(jì)算凋亡百分率,計(jì)算公式:AI=(陽性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù))×100%〔4,5〕。④腫瘤體積生長率測定:前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),開腹采用游標(biāo)卡尺測量時(shí),測量的人為誤差、多次開腹測量后大鼠死亡率增加等原因?qū)Y(jié)果影響很大,并且比較開腹測量與CT測量結(jié)果,發(fā)現(xiàn)兩者沒有明顯差異,所以本研究采用CT測量腫瘤大小。CT掃描條件:120 k V,140 mA,FOV 25,層厚、層距均為3 mm。測量方法:CT掃描測量腫瘤體積VT=1/6π(A×B×C)。A為腫瘤最大層面的前后徑,B為腫瘤最大層面左右徑,C為CT所有層面的上下徑。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件,數(shù)據(jù)資料以±s表示,組間比較采用 χ2檢驗(yàn)或方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 目的基因m RNA的表達(dá) 三者RT-PCR結(jié)果顯示,在治療組和聯(lián)合組的大鼠腫瘤內(nèi),可見到大小為1 400 bp的血管抑素mRNA特異性表達(dá)條帶;而對照組未見到血管抑素mRNA表達(dá)。見圖1。

圖1 肝癌組織內(nèi)血管抑素mRNA的表達(dá)

2.2 三組治療后腫瘤體積的比較 治療組和聯(lián)合組不同時(shí)間的腫瘤生長率均小于對照組(P＜0.01)。聯(lián)合組腫瘤生長率最小。見表1。

表1 不同組別腫瘤生長率的變化(±s,n=20)

表1 不同組別腫瘤生長率的變化(±s,n=20)

與空白對照組比較:1)P＜0.01;下表同

組別 7 d 14 d 21 d空白對照組 8.49±1.35 24.65±4.57 44.42±8.79聯(lián)合組 2.68±1.431) 4.89±1.97 1) 6.78 ±2.451)治療組 5.98±1.921) 16.58±2.381) 24.75 ±4.541)

2.3 干預(yù)后各組的MVD、AI結(jié)果比較 經(jīng)過治療后,治療組和聯(lián)合組MVD均低于對照組,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01);治療組和聯(lián)合組AI均高于對照組,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)。表明血管抑素基因主要作用于新生血管內(nèi)皮細(xì)胞。聯(lián)合組MVD最低,提示多種具有協(xié)同作用的因素相互作用后抑瘤效果最好。見表2。

表2 不同組別治療后MVD和AI的變化(±s,n=20)

表2 不同組別治療后MVD和AI的變化(±s,n=20)

組別 MVD AI空白對照組 61.54±11.36 5.46±1.54聯(lián)合組 29.68±3.42 1) 24.85±3.951)治療組 45.93±7.69 1) 15.58±3.481)

3 討 論

肝癌是常見的惡性腫瘤,發(fā)生和發(fā)展非常復(fù)雜,其根本的原因和致病機(jī)制仍沒有十分清楚,所以傳統(tǒng)的手術(shù)、放療、化療等治療手段至今對于肝癌患者,特別是中晚期患者并不能收到滿意的療效。從上世紀(jì)中期人們開始認(rèn)識到腫瘤生長和轉(zhuǎn)移需要腫瘤血管的支持,20世紀(jì)70～90年代已經(jīng)證實(shí)腫瘤生長與腫瘤血管生長的關(guān)系密切,并提出“腫瘤血管平衡開關(guān)學(xué)說”。這些理論為血管基因治療腫瘤方案的制訂和完善打下堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。而許多研究〔2,6〕表明,血管抑制基因的長期應(yīng)用并不引起腫瘤耐藥性,所以抑制腫瘤血管的基因治療研究受到許多學(xué)者的重視。在眾多肝癌基因療法中,抑制腫瘤血管的基因直接作用于腫瘤供血血管,能夠明顯抑制腫瘤血管的生長和轉(zhuǎn)移,從而達(dá)到抑制肝癌生長和轉(zhuǎn)移的效果。本研究的主要意義為明確血管抑素聯(lián)合放射性藥物32P-膠體的抑瘤效果,以便為肝癌的基因治療奠定一個(gè)堅(jiān)實(shí)的理論和技術(shù)基礎(chǔ)。

本研究通過腫瘤體積、腫瘤MVD、腫瘤AI等指標(biāo)均可證明局部給予的血管抑素可以達(dá)到抑制腫瘤生長的目的。這可能與血管抑制基因的產(chǎn)物通過抑制腫瘤新生血管的生長、遷移而達(dá)到治療的作用有關(guān)〔7,8〕。除單一的血管抑素基因治療能夠產(chǎn)生抑制腫瘤血管生長的作用外,本研究還發(fā)現(xiàn):血管抑素和放射性藥物32P-膠體的聯(lián)合應(yīng)用可產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng),即聯(lián)合基因治療的抑瘤效果明顯好于血管抑素基因單一作用。32P-膠體顆粒直徑1～2 μ m,發(fā)射純 β射線,最大能量1.71 mev,平均能量0.69 mev,最大射程8 mm,組織內(nèi)射程2～4 mm,14.28 d,99%能量累積在瘤內(nèi)注射部位4 mm組織內(nèi)。32P-膠體注入瘤內(nèi)后,由于膠體顆粒大,大部分藥物滯留于肝癌腫瘤組織內(nèi),腫瘤組織內(nèi)受到的損傷大于周圍正常組織,從而降低腫瘤的復(fù)發(fā)。本研究可初步推斷:血管抑素和放射性藥物32P-膠體通過抑制腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖及遷移達(dá)到抑瘤的目的,具有很好的抗肝癌療效。

1 Schmitz V,Tirado-Ledo L,Raskopf E,et al.Effective antitumour monoand combination therapy by gene delivery of angiostatin-like molecule and interleukin-12 in a murine hepatoma model〔J〕.Int J Colorectal Dis,2005;20(6):494-501.

2 Isayeva T,Ren C,Ponnazhagan S.Intraperitoneal gene therapy by rAAV provides long-term survival against epithelial ovarian cancer independently of survivin pathway〔J〕.Gene Ther,2007;14(2):138-46.

3 Yang W,Li XY.Anti-tumor effect of pEgr-interferon-gamma-endostatin gene-radiotherapy in mice bearing Lewis lung carcinoma and its mechanism〔J〕.Chin Med J(Engl),2005;118(4):296-301.

4 Zolota V,Gerokosta A,Melachrinou M,et al.Microvessel density,proliferating activity,p53 and bcl-2 expression in situ ductal carcinoma of the breast〔J〕.Anticancer Res,1999;19(4B):3269-74.

5 Park YN,Kim YB,Yang KM,et al.Increased expression of vascular endothelial growth factor and angiogenesis in the early stage of multistep hepatocarcinogenesis〔J〕.Arch Pathol Lab Med,2000;124(7):1061-5.

6 Sun X,Vale M,Jiang X,et al.Antisense HIF-1 alpha prevents acquired tumor resistance to angiostatin gene therapy〔J〕.Cancer Gene Ther,2010;17(8):532-40.

7 Cavallaro U,Christofori G.Molecular mechanisms of tumor angiogenesis and tumor progression〔J〕.J Neurooncol,2000;50(1/2):63-70.

8 Sim BK,Macdonald NJ,Gubish ER.Angiostatin and endostatin:endogenous inhibitors of tumor growth〔J〕.Cancer Metastasis Rev,2000;19(1/2):181-90.