不同年齡帕金森病小鼠模型脊髓前角細胞的超微結構變化

陳 敏 勞 明 韋獻良 劉承偉 (桂林醫(yī)學院人體解剖學教研室,廣西 桂林 54004)

帕金森病(PD)是一種常見的主要影響老年人的神經系統(tǒng)疾病,其癥狀主要為軀體隨意運動障礙,表現(xiàn)為震顫、肌肉僵硬和運動障礙等軀體運動和肌張力改變。脊髓前角運動細胞作為軀干四肢運動傳導通路的下運動神經元,是支配軀體隨意運動的重要組成部分。本實驗采用MPTP誘導C57BL/6J小鼠制備PD模型,試圖說明PD中脊髓前角是否出現(xiàn)病理改變以及出現(xiàn)怎樣的改變,并通過不同年齡小鼠的分組探索年齡因素與病理改變的相關性。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康雄性C57BL/6J小鼠,SPF級,8周齡16只,18月齡18只,體重20～25 g,由南京大學模式動物研究所提供,飼以我校實驗動物中心提供的飼料(成分為大米粉、玉米粉、魚粉等)。自由攝食、飲水,適應喂養(yǎng)1 w。實驗室溫度25℃～28℃,通風、自然采光。

1.2 主要試劑 1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(MPTP)。

1.3 動物分組及建立模型 將8周齡和18月齡各隨機分成模型組和對照組,即8周齡模型組,8周齡對照組,18月齡模型組,18月齡對照組,各組均為8只。(18月齡模型組原有10只,在建模過程中死亡2只而退出實驗。)模型組:每日上午10點腹腔注射MPTP(30 mg/kg體重),每日一次,連續(xù)五日;對照組:與模型組同天腹腔注射同體積的生理鹽水,連續(xù)五日。

1.4 電鏡標本制作方法 1%戊巴比妥(40 mg/kg)麻醉,快速開胸,經左心室插管至升主動脈,快速灌注生理鹽水(p H=7.4),緩慢4%多聚甲醛-2.5%戊二醛灌注。從椎管中取出脊髓,切取頸膨大和腰骶膨大,切成1 mm3小塊,按電鏡常規(guī)做成超薄切片,醋酸鈾-枸櫞酸鉛染色。

2 結 果

2.1 行為學觀察 模型組在注射MPTP 5～10 min內顯得躁動不安,在籠內來回奔跑、爬高,出現(xiàn)立毛、細小震顫,以下頜呈點頭狀震顫常見。10 min后開始運動減少,蜷縮成團,籠內幾只老鼠多聚臥在一起,此時立毛、豎尾、弓背明顯,誘導其活動時步態(tài)不穩(wěn),以后肢明顯,時見拖曳前行。皮毛散亂,失去光澤。目光呆滯,對外界刺激反應降低或根本無反應。3 h后以上急性中毒反應減弱,12 h后基本消失,但運動仍減少。

2.2 脊髓前角超微結構改變 神經元水樣變性,線粒體腫脹,嵴間隙變寬,嵴消失,基質濃度降低和部分空泡化;粗面內質網減少、脫顆粒;溶酶體增多,內有吞噬小泡,尤以18月齡模型組明顯。凋亡神經元較多,細胞皺縮,核染色質濃縮、邊集,胞漿濃縮,電子密度增加。脹亡神經元胞體明顯腫脹,核染色質分散,邊集,胞膜斷裂,胞質出現(xiàn)蟲蝕狀和空泡化,細胞器減少,線粒體腫脹,粗面內質網擴張(圖1)。神經元軸突樹突腫脹透亮,微絲、微管失去正常整齊排列,呈斷裂、卷曲狀,髓鞘褪變,板層斷裂、分離。星形膠質細胞增生、肥大,常成群分布,細胞胞體、胞核增大,胞漿豐富,其內細胞器也增多。小膠質細胞增多不明顯,胞體增大,突起變短增粗或消失,胞質內溶酶體豐富。廣泛出現(xiàn)血腦屏障(BBB)通透性增加的改變。對照組未發(fā)現(xiàn)有病理改變。

圖1 脊髓前角超微結構改變(×10 000)

3 討 論

3.1 MPTP的制模機制和PD模型成功的指標 MPTP為強脂溶性化合物,極易透過血腦屏障,但在大腦和小腦中分布較少。MPTP本身沒有毒性,可以選擇性地濃集于黑質周圍,被膠質細胞攝取后,在線粒體內由單氨氧化酶B(MAO-B)使之轉變?yōu)?-甲基-4-苯基吡啶(MPP+),MPP+的結構和 DA比較類似,被黑質神經元末梢攝取后,通過抑制線粒體的呼吸功能,產生氧自由基和Ca2+內流的改變等作用使黑質神經元細胞壞死、凋亡,產生類似于PD的癥狀和病理改變〔1〕。因此,MPTP是制作PD模型的 理想藥 物〔2〕。 C57BL/6J小鼠對 MPTP 較 為敏 感〔3〕,MPTP誘導的C57BL/6J小鼠PD模型10多年來已在各國實驗室廣泛采用。

在本實驗中,我們以中等劑量〔4〕(30 mg/kg體重,連續(xù)5 d)的MPTP腹腔注射誘導的C57BL/6J小鼠PD模型,小鼠打藥后出現(xiàn)急性中毒反應,表現(xiàn)出典型的PD行為學改變,電鏡觀察到包括黑質致密區(qū)在內的中腦腹側多巴胺能神經元的嚴重缺失(資料待發(fā)表),本實驗結果顯示在脊髓前角出現(xiàn)神經元的缺失和星形膠質細胞的增生等與黑質的改變類似,因此,我們認為所建模型是成功的。

3.2 年齡因素與病理改變的相關性 年齡老化導致多巴胺遞質逐年減少,但老年人患病者僅為少數,且好發(fā)年齡通常在51～60歲之間,按年齡推斷,如果老化是惟一病因的話,此時多巴胺水平尚未達到足夠低的程度,說明生理性多巴胺能神經元退變不足以引起本病,只有黑質多巴胺神經元減少50%以上,紋狀體多巴胺遞質減少80%以上,才會出現(xiàn)PD的臨床運動癥狀,而正常神經系統(tǒng)老化并不會達到這一水平。此外,正常老化發(fā)生的黑質多巴胺能神經元脫失的形式與PD不同,前者的神經元脫失位于黑質背層,而后者的神經元脫失絕大部分位于腹外側層,絕少部分位于背層。因此,年齡老化只是PD的促發(fā)因素之一。

實驗選取了8周齡和18月齡的兩個年齡段小鼠作為實驗對象進行分組研究,考察年齡因素與病理改變的相關性。實驗過程中,在相同的劑量和條件下,均是18月齡組小鼠出現(xiàn)死亡情況,我們考慮是由于老齡小鼠對藥物毒性作用的耐受力較弱,且本實驗數據結果分析中老齡模型組的病理改變較成年模型組更為顯著,提示年齡老化確實是PD發(fā)生不可忽視的原因。隨著年齡增加,谷胱甘肽過氧化酶及過氧化氫酶減低,單胺氧化酶增加,鐵、銅、鈣聚集,黑色素聚集,且黑質、紋狀體多巴胺神經元發(fā)生退行性變,色素顆粒及神經細胞脫失,均為正常神經系統(tǒng)老化的改變,但同時又是PD病理變化的基礎。因此,我們認為,用老齡小鼠制備PD模型更能模擬PD真實的發(fā)病條件,是更為適當的選擇。

3.3 PD中的脊髓前角改變 PD是臨床一大頑癥,雖經國內外學者多年的潛心研究,但是其發(fā)病機制尚不完全清楚。目前一般研究認為PD的發(fā)生與紋狀體-黑質-紋狀體錐體外路系環(huán)路功能障礙有關。在此環(huán)路中,中腦黑質對骨骼肌運動的調節(jié)起著重要作用。黑質的致密部多巴胺能神經元合成釋放DA,并投射到新紋狀體,通過黑質紋體纖維儲存于新紋狀體內,有抑制蒼白球活動作用。所以當黑質受損時,使新紋狀體的多巴胺含量減少80% ～99%,因而來自紋狀體-黑質-蒼白球對脊髓前角運動神經元的抑制大大減弱甚或消失,脊髓前角運動神經元功能被釋放,則出現(xiàn)肌張力增強,運動減少,同時伴有肌震顫〔5〕的發(fā)生。按照此學說,脊髓前角細胞應該沒有受到損傷,只是功能發(fā)生了改變。但是,在本實驗中,我們通過透射電鏡觀察到在PD中脊髓前角細胞發(fā)生了器質性病理改變,包括神經元大量的變性、脹亡及凋亡和神經膠質細胞的增生。脊髓前角神經元大部分為軀體運動神經元,支配軀干和四肢的運動。因此,我們認為,脊髓前角神經元數量的急劇下降以及變性神經元的廣泛出現(xiàn)是導致PD模型組動物運動減少的原因之一。

PD的特征性病理變化之一為膠質細胞增生,主要包括星形膠質細胞和小膠質細胞。在本實驗中觀察到脊髓前角星形膠質細胞廣泛肥大增生,我們認為星形膠質細胞增多的原因如下:MPTP必須被星形膠質細胞攝取,才能轉化成為MPP+,因此,神經元的損傷根源之一于星形膠質細胞的物質代謝。迅速增殖的星形膠質細胞在損傷部位形成一個相對較封閉的環(huán)境,阻止炎癥向其他區(qū)域擴散〔6〕。星形膠質細胞在 PD病變的整個過程中,其數量、形態(tài)以及功能都發(fā)生了變化,產生了種類多、數量大的各種細胞因子及神經營養(yǎng)因子,這些因子相互促進,相互制約,既參與了PD的發(fā)病,更在神經的再生修復過程中發(fā)揮著不可忽視的作用。我們認為,星形膠質細胞對神經元的保護和修復功能遠遠大于它對神經元的損傷,有著廣泛的研究和治療前景。

本實驗發(fā)現(xiàn)小膠質細胞的增生不明顯,但是可見到激活的小膠質細胞。對于這個結果,我們考慮是由于小膠質細胞活化先于神經元變性。有研究表明:小膠質細胞反應于注射MPTP 12 h后開始,12～48 h高峰,7 d后無明顯變化,而酪氨酸羥化酶免疫組化陽性細胞于72 h后開始減少。本實驗中在MPTP注射5 d取材,此時小膠質細胞增生的高峰期已過,因此小膠質細胞的增生不明顯。但是,我們觀察到的小膠質細胞體積大,無突起,有吞噬物,提示此時的小膠質細胞為活化型?；罨男∧z質細胞通過釋放大量的炎性因子產生炎性反應對神經元產生毒性作用。也有學者認為活化的小膠質細胞可以產生抗炎細胞因子〔7〕。但是許多研究證實,活化的小膠質細胞的致病作用遠遠大于它的神經保護作用,如 He等〔8〕于應用鹽酸米諾環(huán)素(美滿霉素)可以抑制PD模型黑質內的小膠質細胞的增生,同時可以保護多巴胺能神經元。

關于脊髓前角產生病理改變的原因,我們考慮有如下可能性:第一,黑質受損累及脊髓。①MPTP在黑質轉化成MPP+后,通過紋狀體-黑質-紋狀體錐體外路系環(huán)路的物質運輸和交換到達脊髓前角,再被脊髓前角神經元的樹突主動攝取,通過抑制線粒體的呼吸鏈導致神經元損害。②黑質病變產生了各種炎性因子、氧自由基等有害物質通過體內循環(huán)的各種途徑到達脊髓,引起脊髓前角細胞產生炎性反應導致病變。第二,脊髓直接受到損害。MPTP直接被脊髓前角的星形膠質細胞攝取,產生MPP+,被脊髓前角神經元攝取而損傷。我們認為脊髓前角細胞的病理性變化是PD運動障礙的原因和結構基礎之一,PD的病變部位更加廣泛,并不局限于黑質和紋狀體,而是涉及中樞神經系統(tǒng)其他部分,甚至是全身性疾病。

但是,在實驗中我們是以MPTP制作PD模型來顯示PD的發(fā)病過程和癥狀,而PD患者的發(fā)病并不是由于MPTP的作用,所以,也有可能是MPTP對脊髓有損害,而PD患者就不一定存在該損害。因此,對于脊髓前角的病變還有待進一步研究。

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