復(fù)元膠囊對氣虛血瘀證模型大鼠血栓前狀態(tài)的影響

徐 丹 李榮亨 李學(xué)榮 (重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科,重慶 400016)

氣虛血瘀證是諸多老年病的常見證候,尤其在心、腦血管疾病中更為常見,中醫(yī)學(xué)認為 “氣為血之帥,氣能行血”,若氣虛鼓動無力,循經(jīng)之血緩慢滯澀瘀積于經(jīng)脈中形成血瘀。目前普遍認為中藥益氣、活血方制劑能有效改善老年病中氣虛血瘀證癥狀。復(fù)元膠囊在益氣、活血中藥的基礎(chǔ)上加用補腎中藥,前期研究表明〔1,2〕,復(fù)元膠囊具有調(diào)節(jié)血管平滑肌細胞 (VSMC)收縮與舒張平衡及調(diào)節(jié)VSMC分泌多種血管活性物質(zhì)的作用。本文采用多因素復(fù)合方法制作大鼠氣虛血瘀證模型,檢測大鼠血漿血管性血友病因子 (vWF)、組織型纖溶酶原激活物 (t-PA)、纖溶酶原激活物抑制物 (PAI)的含量,探討益氣活血補腎復(fù)方復(fù)元膠囊對氣虛血瘀證大鼠血栓前狀態(tài)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 體重500～600 g的16月齡的SD大鼠60只,雌雄各半,由重慶醫(yī)科大學(xué)動物中心提供,合格證號:SCXK(渝)2010-0001。

1.1.2 實驗藥物 復(fù)元膠囊由生曬參、黃芪、丹參、鹿茸、淫羊藿、川芎、枸杞等組成,具有益氣活血補腎的功效,重慶希爾安藥廠生產(chǎn)。每粒膠囊重0.41 g,相當(dāng)于生藥3 g。芪參膠囊由黃芪、丹參、人參、三七、水蛭等組成,具有益氣活血的功效,河南省新誼藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn),批號:Z20064445,每粒膠囊重750 mg。

1.1.3 主要儀器 全自動血液流變測定儀(重慶醫(yī)科大學(xué)附一院中西醫(yī)結(jié)合科提供)、移液槍、離心機、水浴箱、冰箱、試管、酒精燈、真空抗凝采血管、酶標(biāo)儀都由重慶醫(yī)科大學(xué)眼科實驗室提供。

1.1.4 主要試劑 雙蒸水由實驗室提供,大鼠組織型纖溶酶原激活物(TPA)ELISA試劑盒、大鼠纖溶酶原激活物抑制因子(PAI)ELISA試劑盒、大鼠血管性血友病因子/瑞斯托霉素輔因子(vWF)ELISA試劑盒,由上海源葉生物科技有限公司提供,批號:20101227。

1.2 方法

1.2.1 造模 60只SD大鼠在實驗室喂養(yǎng)1 w,適應(yīng)環(huán)境。1 w后隨機抽取10只大鼠為空白組,余下50只大鼠每日攝正常食量的2/3,并加入高脂飼料(每5 kg普通飼料加豬油1 kg),在每日控制食量的基礎(chǔ)上將大鼠放入涼水(10～14℃)中游泳,直至疲勞,將其打撈出水面,撈出后不予保溫及擦拭水跡,使之暴露于空氣中自然晾干。每日一次,連續(xù)4 w,建立氣虛血瘀證模型〔3,4〕,即出現(xiàn)精神萎靡,倦怠嗜睡,攻擊性減退,毛發(fā)枯黃無潤澤,輕度稀便,尾尖出現(xiàn)輕度瘀斑血點。隨機取10只模型大鼠和空白組10只大鼠,抽尾靜脈,測定血液流變學(xué),表明造模成功。見表1。

表1 造模組與空白組血液流變學(xué)的變化(±s,n=10)

表1 造模組與空白組血液流變學(xué)的變化(±s,n=10)

與空白對照組比較:1)P＜0.05

組別 高切(mps)200/s中切(mps)30/s低切(mps)3/s紅細胞聚集指數(shù)(Arbc)電泳時間(s)空白組4.81±0.22 6.00±0.28 9.23±0.56 7.94 ±0.57 17.51±1.17模型組 9.03 ±0.091)11.64 ±0.531)16.61 ±0.29 1)11.09 ±0.381)29.99 ±0.191)

1.2.2 分組 造模成功后將50只SD大鼠隨機分為模型組,芪參膠囊組,復(fù)元低劑量組,復(fù)元中劑量組,復(fù)元高劑量組。

1.2.3 給藥 造模成功后根據(jù) Meeh-Rubner氏公式〔5〕計算給藥劑量,計算出大鼠每日應(yīng)服復(fù)元膠囊(447.49 mg·kg-1·d-1),芪參膠囊(515.7 mg·kg-1·d-1)。按照復(fù)元膠囊大、中、小劑量組以 4∶2∶1的給藥標(biāo)準(zhǔn),灌胃,給藥容量為13.3 ml/kg,模型組和空白組給予等量生理鹽水,每天1次,連續(xù)4 w。芪參膠囊組的給藥劑量為520 mg/kg,每天一次,連續(xù)給藥4 w。動物分組及給藥方法,見表2。

表2 動物分組以及飼養(yǎng)方法

1.2.4 觀察指標(biāo)

1.2.4.1 一般情況 觀察大鼠的精神狀況,對抗及攻擊力,毛發(fā),大便,尾部瘀斑輕重,游泳及耐疲勞時間。

1.2.4.2 血液黏度測定 用真空抗凝管取下腔靜脈血3 ml,采用全自動血液流變測定儀,檢測全血黏度、紅細胞聚集指數(shù)、紅細胞電泳時間。

1.2.4.3 vWF、PAI-1和t-PA測定 給藥4 w后取標(biāo)本:將大鼠用10%水合氯醛(300 mg/kg)腹腔注射麻醉后仰臥固定于手術(shù)臺上,于胸骨柄上一橫指、正中線向右旁開1 cm處做切口,于觸及動脈搏動處分離肌肉可見右側(cè)頸動脈,以5號頭皮針穿刺血管取血,放于含有1/10容積的0.109 mol/L枸櫞酸鈉抗凝試管中,經(jīng)3 000 r/min離心10 min后,收集上清液(血漿,黃色),放置于-20℃低溫冰箱中保存測定。采用酶聯(lián)免疫吸附法測定 vWF,采用ELISA測定PAI-1和 t-PA,均嚴格按照試劑說明書進行操作,根據(jù)所繪標(biāo)準(zhǔn)曲線計算各待測標(biāo)本含量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS.17.0統(tǒng)計學(xué)分析軟件進行處理,計量資料結(jié)果全部采用±s表示,多組均數(shù)間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)和兩兩比較(LSD法)。

2 結(jié) 果

2.1 一般情況 模型組與空白組比較,精神萎靡,對抗性,攻擊性差,毛發(fā)枯黃無光澤,大便稀溏,耐疲勞時間延長,尾尖部出現(xiàn)不同程度的瘀血點。芪參膠囊組與模型組比較,精神有所改善,對抗性攻擊性較好,毛發(fā)枯黃稍有光澤,大便稍稀溏,尾部瘀血點改善不明顯。復(fù)元膠囊各組與模型組比較,精神好,對抗性攻擊性強,毛發(fā)潤澤,大便成形,耐疲勞時間與空白組相當(dāng),尾部瘀斑明顯減退。

2.2 WF、PAI-1和t-PA含量 模型組與空白組比較,vWF、PAI-1含量明顯升高,t-PA明顯下降(P＜0.05)。復(fù)元膠囊各組、芪參膠囊組與模型組比較,vWF、PAI-1含量明顯下降,t-PA明顯升高(P＜0.05),其中復(fù)元膠囊中劑量組作用效果最為明顯,且復(fù)元膠囊各組vWF、PAI-1含量低于芪參膠囊組(P＜0.05),而復(fù)元膠囊各組 t-PA高于芪參膠囊組(P＜0.05)。見 表3。

表3 各組大鼠t-PA、PAI、vWF比較(±s)

表3 各組大鼠t-PA、PAI、vWF比較(±s)

與模型組比較:1)P＜0.01;與芪參膠囊組比較:2)P＜0.01

組別 n t-PA(IU/ml) PAI(IU/ml) vWF(IU/ml)空白組 10 0.998 ±0.0761) 0.346±0.0361) 0.346±0.0361)模型組 9 0.277±0.054 0.974±0.032 0.974±0.032芪參膠囊組 9 0.465±0.0511) 0.762±0.0251) 0.762±0.0251)復(fù)元膠囊低劑量組 10 0.668±0.0631)2) 0.612±0.038 1)2) 0.612±0.0381)2)復(fù)元膠囊中劑量組 9 0.971±0.0381)2) 0.347±0.031 1)2) 0.347±0.0311)2)復(fù)元膠囊高劑量組 9 0.681±0.0631)2) 0.632±0.017 1)2) 0.632±0.2251)2)

3 討 論

本實驗采用饑餓、勞累、高脂等多因素復(fù)合作用來建立氣虛血瘀證模型。根據(jù)中醫(yī)氣血關(guān)系理論,氣為血帥,氣能推動血液運行,氣虛則氣不行血,氣不攝血,導(dǎo)致血瘀;根據(jù)中醫(yī)病因病機方面考慮,氣虛血瘀證病機是氣虛為本在先,血瘀為標(biāo)產(chǎn)生于后,故造模重點應(yīng)放在血瘀之根本原因-氣虛的致病因素上。本實驗采用上述多因素復(fù)合方法成功制作了氣虛血瘀證模型,大鼠出現(xiàn)了不同程度的氣虛、血瘀相關(guān)癥狀表現(xiàn),體重減輕,血液流變學(xué)異常,復(fù)合大鼠氣虛血瘀證模型。

血栓前狀態(tài)是指各種原因引起的血管內(nèi)皮細胞、血小板功能、纖溶系統(tǒng)等有關(guān)因子發(fā)生變化或血黏滯度增加所引起的病理狀態(tài),有利于血栓形成的病理過程。

vWF是血管內(nèi)皮細胞特異性標(biāo)志物之一〔6〕,vWF在微血管內(nèi)皮細胞受到刺激時釋放至血漿,其水平升高可作為微血管內(nèi)皮細胞受損的標(biāo)志〔7〕,vWF與微血管病變的關(guān)系密切。t-PA的血液含量及活性能直接反映纖溶系統(tǒng)功能,可預(yù)測血栓形成的危險度〔8〕。體內(nèi)同時存在著纖溶酶原激活物抑制物(PAI),通過與t-PA形成1∶1分子復(fù)合物,使t-PA失活〔9〕。t-PA與PAI是維持凝血與纖溶動態(tài)平衡的一對重要因子,兩者失衡則易導(dǎo)致出血或凝血。氣虛血瘀證多見于心腦血管疾病,慢性腎病,腫瘤等,上述疾病都較易容易形成血栓。

本實驗研究結(jié)果說明氣虛血瘀證大鼠不僅存在內(nèi)皮細胞的結(jié)構(gòu)或功能的異常,同時還處在一個血栓前狀態(tài)。祖國醫(yī)學(xué)認為,氣有推動,固攝,溫煦血液的功能,氣虛則上述功能減弱,導(dǎo)致血液停滯而瘀。腎為先天之本,腎氣衰則元氣亦衰。因此補腎氣是治療氣虛病證的根本。芪參膠囊(黃芪、丹參、人參、三七、水蛭等)是由益氣活血中藥組成的,復(fù)元膠囊在益氣活血中藥的基礎(chǔ)上加用補腎藥,如鹿茸、淫羊藿、肉蓯蓉等,具有益氣活血補腎之功效。實驗證實三七皂苷、水蛭素、黃芪、人參皂苷有調(diào)節(jié)凝血與纖溶的作用,改善 t-PA 與 PAI的失衡〔10～13〕。本實驗可見加有補腎中藥的復(fù)元膠囊能更有效的改善血栓前狀態(tài),且沒有藥物劑量依賴性。

本研究表明了運用益氣活血法補腎比單用益氣活血法更能有效的調(diào)節(jié)氣虛血瘀證大鼠的血栓前狀態(tài),維持t-PA/PAI之間的平衡,其作用機制可能與降低vWF因子含量,改善內(nèi)皮細胞功能或結(jié)構(gòu)有關(guān)。復(fù)元膠囊中補腎藥物的藥理研究中,沒有報道有直接影響凝血、纖溶因子的作用,更確切的機制有待更進一步的研究。

1 覃喬靜,李榮亨 .氣虛血瘀證血漿NPY、ET、CGRP的改變及相關(guān)性研究〔J〕.重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2003;28(2):202-4.

2 呂 霞,李榮亨,榮曉鳳 .復(fù)元膠囊對氣虛血瘀證大鼠血管內(nèi)皮細胞功能的影響〔J〕.中藥新藥與臨床藥理,2008;19(5):369-71.

3 廖慧玲,尹思源,楊思進 .從血液流變學(xué)看多因素復(fù)合制作氣虛血瘀腦缺血動物模型〔J〕.陜西中醫(yī),2007;28(6):750-1.

4 尹軍祥,田金洲 .氣虛血瘀證動物模型制作方法與評價〔J〕.中華中醫(yī)藥雜志,2006;21(7):424-6.

5 徐叔云,卞如濂,陳 修.藥理學(xué)實驗方法〔M〕.北京:人民衛(wèi)生出版社,2002:203-4.

6 Esposito K,Marfalla R,Ciotola M,et al.Effect of a Mediterranean style diet on endothelial dysfunction and markers of vascular inflammation in the metabolic syndrome:a randomized trial〔J〕.JAMA,2004;292(12):1440-6.

7 Ouvina SM,La-Greca RD,Zanaro NL,et al.Endothelial dysfunction,nitric oxide and platelet activation in hypertensive and diabetic typeⅡpatients〔J〕.Thromb Res,2001;102(2):107-14.

8 Amell JW,Sweetnam PM,Rumley A,et al.Lifestyle and hemostatic riskfactors for ischemic heart disease:the Caerphilly Study〔J〕.Arterioscler Thromb Vasc Biol,2000;20(3):271-9.

9 阮長耿.血栓與止血現(xiàn)代理論和臨床實踐〔M〕.南京:江蘇科學(xué)技術(shù)出版社,1994:133-66.

10 詹合琴,楊錦南,沈志強 .三七皂苷R91對tPA和PAI-1活性的調(diào)節(jié)作用〔J〕.天然產(chǎn)物研究與開發(fā),2006;18:556-8.

11 黎 明,張榮軍,曹國憲,等 .水蛭素對凝血過程中凝血酶活化的纖溶抑制物的影響〔J〕.中華血液學(xué)雜志,2006;27(3):201-2.

12 韋先進,朱辟疆 .黃芪對難治性腎病綜合征凝血纖溶的影響〔J〕.中國中西醫(yī)結(jié)合腎病雜志,2002;12(3):709-10.

13 鄭傳東,閔 蘇 .參附改善心臟直視手術(shù)凝血-纖溶動態(tài)平衡的作用〔J〕.中藥藥理與臨床,2008;24(2):96-8.