異丙酚舒張離體大鼠肺內動脈的作用及機制*

張光燕，鄧春玉，鄺素娟，馬 玨，崔建修△

(1南方醫(yī)科大學，廣東 廣州 510515;廣東省醫(yī)學科學院，廣東省人民醫(yī)院2醫(yī)學研究中心，3麻醉科，廣東 廣州 510080)

異丙酚是常用的靜脈麻醉藥，臨床使用時能引起心血管功能抑制效應，導致血壓下降。前期已有的研究［1，2］證實異丙酚對血管有直接作用，但具體機制還存在爭議。有研究證明異丙酚有舒張血管效應，這種舒張血管效應已在幾組體外實驗中得到證實，如狗的冠狀動脈［3］，大鼠的胸主動脈［4］、肺動脈［5］及人的胎盤血管［6］，而在對狗的肺動脈［7］及大鼠灌注肺的研究［8］中則證明異丙酚可以增加血管的阻力。另一些實驗［9，10］表明異丙酚作用于血管主要是通過內皮作用，相反有研究［11］表明其作用是非內皮依賴性的。本實驗旨在進一步明確異丙酚的血管效應，本研究采用大鼠二級分支肺內動脈為研究對象，觀察異丙酚對外周阻力血管張力的影響以及其作用機制。

材料和方法

1 動物

SPF級健康成年雄性SD大鼠，體重200～300 g，購于中山大學動物實驗中心，許可證號為SCXK(粵)2009-0011。

2 試劑與儀器

2.1 主要試劑、藥品及溶液 戊巴比妥鈉為Merk產品;異丙酚原液(2，6-diisopropylphenol)、血栓素 A2類似物(9，11-dideoxy-11α，9α -epoxymethanoprostaglandin，U46619)、乙酰膽堿(acetylcholine，ACh)、硝苯地平(nifedipine)、EGTA、左旋硝基精氨酸甲酯(Nm-nitro-L-arginine methyl ester hydrochloride，L-NAME)和DMSO均為Sigma產品，其余試劑為國產分析純。異丙酚、U46619及硝苯地平溶于DMSO，其余試劑溶于超純水，對照組已證明最高濃度DMSO(1∶500)對血管張力無影響。Kreb's液(mmol/L:119 NaCl，4.7 KCl，2.5 CaCl2，1 MgCl2·6H2O，25 NaHCO3，1.2 KH2PO4，11.1葡萄糖)。60 mmol高 K+(mmol/L:63.7 NaCl，60 KCl，2.5 CaCl2，1 MgCl2·6H2O，25 NaHCO3，1.2 KH2PO4，11.1 葡萄糖)。無鈣的 Kreb's液(mmol/L:119 NaCl，4.7 KCl，500 EGTA ，1 MgCl2·6H2O ，25 NaHCO3，1.2 KH2PO4，11.1葡萄糖)。無鈣高 K+(mmol/L:63.7 NaCl，60 KCl，1 MgCl2·6H2O ，25 NaHCO3，1.2 KH2PO4，11.1葡萄糖)。

2.2 儀器 血管張力換能器(DMT)，Stemi DV4體式解剖顯微鏡(Seizz)。

3 方法

3.1 血管環(huán)的制備 150 mg/kg戊巴比妥鈉過量麻醉大鼠后放血，迅速取出心肺組織，在預冷的Kreb's液(4℃)中洗凈殘血，移入盛有預冷Kreb's液并裝有硅膠板的培養(yǎng)皿中，用大頭釘將心肺組織固定于硅膠板，仔細辨認肺動脈，沿肺動脈主干分離出二級肺內動脈，制備直徑為200～300 μm，長度為1～2 mm的動脈環(huán)，掛于血管張力器的浴槽中，并持續(xù)通入95%O2與5%CO2混和氣，溫度恒定在37℃。平衡1 h調節(jié)血管靜息張力至2 mN，并用高鉀收縮血管，洗去高鉀30 min后再重復1次，對高鉀反應良好者說明血管舒縮功能完好，實驗中每隔15 min換Kreb's液1次。為避免異丙酚的佐劑對實驗的影響，本實驗使用異丙酚純液。

3.2 張力測試

①內皮完整性的測定 未去內皮的血管條用U46619100 nmol/L收縮血管，待張力平衡后加入1 μmol/L ACh舒張，舒張率達到60%以上者認為內皮完整。使用鋼絲來回輕柔地摩擦血管內壁幾次制備去內皮的血管條，用U46619100 nmol/L收縮血管，以ACh舒張率為零或接近零認為內皮去除完整。

②測定異丙酚的血管舒張效應 不同的內皮完整的血管環(huán)分別用高鉀溶液60 mmol/L或U46619100 nmol/L收縮血管后，累計加入異丙酚濃度:1、3、10、30、100、300 μmol/L，記錄張力的變化。

③測定內皮對異丙酚舒張血管的作用 內皮完整組使用U46619100 nmol/L收縮血管，張力平衡后累積加入異丙酚1、3、10、30、100、300 μmol/L，記錄張力的變化，然后用Kreb's液洗脫浴槽中藥物，洗4次，待血管恢復靜息張力后加入一氧化氮合酶抑制劑L-NAME 1 μmol/L孵育30 mim，使用U46619100 nmol/L 收縮血管，張力平衡后累積加入異丙酚1、3、10、30、100、300 μmol/L，比較孵育前、后的張力變化差異。去內皮組使用U46619100 nmol/L收縮血管，張力平衡后累積加入異丙酚1、3、10、30、100、300 μmol/L，記錄張力變化。

④測定Ca2+通道與異丙酚舒張血管的關系 用含EGTA 500 μmol/L的無鈣Kreb's將浴槽中的液體置換3次，加入無鈣高鉀溶液，然后累積加入 CaCl2濃度:0.01、0.03、0.1、0.3、1、3mmol/L記錄張力變化，Kreb's液洗脫4次，至血管恢復靜息張力，平衡30min，再用含EGTA 500 μmol/L的Kreb's將浴槽中的液體置換3次，加入無鈣高鉀溶液后，不同的血管分別用異丙酚 10、30、100、300 μmol/L 預孵育 30 min，累積加入CaCl2濃度:0.01、0.03、0.1、0.3、1、3 mmol/L，記錄張力變化并與孵育前比較。另一些血管用高鉀溶液收縮，張力平衡后加入L-型鈣通道阻斷劑硝苯地平(nifedipine，1 μmol/L)充分阻斷L-型鈣通道，加入U46619100 nmol/L再次收縮血管，待張力穩(wěn)定后累積加入異丙酚 1、3、10、30、100、300 μmol/L，記錄張力變化。以高鉀或U46619誘發(fā)的血管最大收縮幅度為100%，加入藥物后血管的收縮或舒張與最大收縮幅度的比值反映血管張力的變化，EC50表示產生50%最大舒張效應時對應的藥物濃度，親和力指數(shù)(avidity index)簡稱pD2，表示引起最大效應的一半時所需的藥物摩爾濃度的負對數(shù)，pD2=-lg(EC50)。量效曲線應用GraphPad Prism 3.0繪制和分析。

4 統(tǒng)計學處理

結 果

1 異丙酚對預收縮大鼠肺內動脈張力的影響

異丙酚可舒張高鉀和U46619引起的肺血管收縮，且產生濃度依賴的舒張效應。高鉀組最大舒張效應Emax=(97.57±2.05)%，pD2=4.38±0.08，U46619組最大的舒張效應Emax=(88.18±10.33)%，pD2=4.15 ±0.27，見圖1、2。

Figure 1.Propofol induced relaxation in rings precontracted by 60 mmol/L K+-containing solution..n=6.圖1 異丙酚對高K+預收縮血管的舒張效應

Figure 2.Propofol induced relaxation in rings precontracted by U46619..n=6.圖2 異丙酚對U46619預收縮血管的舒張效應

2 內皮對異丙酚舒張肺動脈的影響

異丙酚能舒張U46619預收縮的內皮完整與去內皮的血管，內皮完整組最大舒張效率Emax=(82.60±22.15)%，pD2=4.21±0.26，L-NAME孵育后最大舒張效率Emax=(77.62±26.58)%，pD2=4.01±0.28，兩組比較無顯著差異(P＞0.05);去內皮組最大舒張效率 Emax=(86.27±18.37)%，pD2=4.41±0.36，與內皮完整組比較無顯著差異(P＞0.05)，見圖3。

Figure 3.Propofol-induced relaxation in rings precontracted by U46619 in endothelium-intact，endothelium-denuded and L-NAME treatment groups..n=5.圖3 異丙酚分別在內皮完整、L－NAME處理和去內皮組對U46619預收縮血管的舒張效應

3 Ca2+通道與異丙酚舒張血管的關系

3.1 異丙酚對CaCl2誘導血管收縮作用的影響 不同濃度異丙酚(10、30、100、300μmol/L)孵育血管后，CaCl2(0.01-3 mmol/L)刺激血管收縮的劑量-效應曲線明顯向右移動，最大收縮幅度Emax降低，呈明顯的濃度依賴性，這一結果反映異丙酚可以明顯抑制細胞外鈣內流，見圖4。

3.2 異丙酚對U46619敏感受體操縱性鈣通道(receptoroperated calcium channels，ROCC)的作用 高鉀收縮血管待張力平衡，加入L型鈣通道阻斷劑硝苯地平1 μmol/L后，血管張力可降至靜息張力水平，說明此濃度的硝苯地平將L-型鈣通道完全阻斷，再使用U46619收縮血管，異丙酚仍可以舒張U46619預收縮的肺動脈，且最大舒張率Emax=(88.97±5.60)%。這一結果反映異丙酚可能抑制了ROCC相關的鈣內流。

Figure 4.CaCl2-induced contraction in Ca2+-free，60 mmol/L K+-containing solution in the absence or presence of propofol(10 to 300 μmol/L)..n=5.*P＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control(propofol 0 μmol/L).圖4 不同濃度異丙酚孵育前后，血管在無鈣高鉀中對CaCl2的收縮反應。

討 論

本研究探討了異丙酚對大鼠肺內動脈的張力影響，主要的發(fā)現(xiàn)如下:(1)異丙酚可舒張受體依賴及非受體依賴的血管收縮;(2)異丙酚舒張血管不依賴于內皮;(3)異丙酚舒張血管的部分機制可能與抑制VOCC與ROCC相關的鈣內流有關。異丙酚可舒張由非受體依賴性的高K+引起的血管收縮和受體依賴的U46619引起的血管收縮，但是舒張的強度不等，300 μmol/L的異丙酚舒張高 K+預收縮的血管大于U46619預收縮的血管。U46619是血栓素類似物，作為血栓素受體A2(thromboxane A2，TXA2)的激動劑收縮血管，TXA2的增高反映了內皮功能的紊亂，異丙酚用于內皮功能紊亂的病人有可能改善血栓素引起的血管收縮。

血管內皮細胞可以合成和分泌許多血管活性物質調節(jié)血管平滑肌舒縮。NO是重要的血管舒張因子之一，它由L-精氨酸在一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)作用下合成。NO激活可溶性鳥苷酸環(huán)化酶，使平滑肌細胞內cGMP水平升高，從而使細胞內Ca2+減少，引起平滑肌松弛。LNAME可阻斷NOS，減少NO的釋放，阻斷下游途徑引起的平滑肌松弛［11］。異丙酚舒張內皮完整的血管，使用L-NAME孵育后，舒張率無顯著差異，證明異丙酚舒張血管與eNOSNO-cGMP途徑無關。異丙酚舒張去內皮的肺內動脈，且舒張率與內皮完整組無顯著差異，說明其引起血管舒張的主要機制依賴于平滑肌層。在一項對離體大鼠胸主動脈的研究［12］中同樣觀察到異丙酚舒張血管不依賴于內皮，且可能是由于異丙酚阻斷了電壓門控性鈣通道從而阻斷了鈣內流。另一項對離體大鼠腎動脈的研究［13］中發(fā)現(xiàn)，異丙酚能減小高K+、去甲腎上腺素、5-羥色胺及U46619引起的血管收縮，且異丙酚抑制高K+收縮的血管的效能最大，表明其舒張腎動脈的機制可能涉及到抑制細胞外鈣內流。本實驗與上述實驗結果相近。高K+狀態(tài)下細胞膜去極化，電壓門控性鈣通道(voltage-operated calcium channels，VOCC)處于開放狀態(tài)，增加胞外鈣離子的濃度可使鈣通過電壓門控性通道進入胞內引起收縮。使用不同濃度的異丙酚孵育血管，可觀察到孵育前后鈣離子引起血管收縮有顯著差異，且異丙酚抑制鈣內流呈濃度依賴性，說明異丙酚可能抑制VOCC相關的鈣內流。

血管平滑肌細胞收縮時，胞外鈣內流主要通包括VOCC與ROCC［14］。本實驗使用硝苯地平充分阻斷L型鈣通道后，排除L型鈣通道影響下異丙酚仍能舒張U46619收縮的血管，這一部分作用可能與TXA2敏感的ROCC相關。ROCC是細胞膜上存在的重要的外Ca2+內流通道，其開放與膜的去極化無關，與受體結合后可使受體依賴的鈣通道直接開放，同時可于G蛋白偶聯(lián)，通過蛋白激酶途徑與Rho蛋白激酶(ROCK)信號調節(jié)血管平滑肌對Ca2+敏感性。

綜上，異丙酚可舒張高鉀及U46619預收縮的肺內動脈，且不依賴于內皮，其部分機制可能抑制了VOCC與ROCC相關的鈣內流有關。

［1］Yamanoue T，Brum JM，Estafanous FG.Vasodilation and mechanism of action of propofol in porcine coronary artery［J］.Anesthesiology，1994，81(2):443-451.

［2］Kamitani K，Yamazaki M，Yukitaka M，et al.Effects of propofol on isolated rabbit mesenteric arteries and veins［J］.Br J Anaesth，1995，75(4):457-461.

［3］Klockgether-Radke AP，Schulze H，Neumann P，et al.Activation of the K+channel BK(Ca)is involved in the relaxing effect of propofol on coronary arteries［J］.Eur J Anaesthesiol，2004，21(3):226-230.

［4］Yu J，Kakutani T，Mizumoto K，et al.Propofol inhibits phorbol 12，13-dibutyrate-induced，protein kinase C-mediated contraction of rat aortic smooth muscle［J］.Acta Anaesthesiol Scand，2006，50(9):1131-1138.

［5］Ouédraogo N，Mounka?la B，Crevel H，et al.Effect of propofol and etomidate on normoxic and chronically hypoxic pulmonary artery［J］.BMC Anesthesiol，2006，6:2.

［6］Soares de Moura R，Silva GA，Tano T，et al.Effect of propofol on human fetal placental circulation［J］.Int J Obstet Anesth，2010，19(1):71-76.

［7］Ogawa K，Tanaka S，Murray PA.Propofol potentiates phenylephrine-induced contraction via cyclooxygenase inhibition in pulmonary artery smooth muscle［J］.Anesthesiology，2001，94(5):833-839.

［8］Edanaga M，Nakayama M，Kanaya N，et al.Propofol increases pulmonary vascular resistance during alpha-adrenoreceptor activation in normal and monocrotaline-induced pulmonary hypertensive rats［J］.Anesth Analg，2007，104(1):112-118.

［9］Park WK，Lynch CR，Johns RA.Effects of propofol and thiopental in isolated rat aorta and pulmonary artery［J］.Anesthesiology，1992，77(5):956-963.

［10］Boillot A，Laurant P，Berthelot A，et al.Effects of propofol on vascular reactivity in isolated aortae from normotensive and spontaneously hypertensive rats［J］.Br J Anaesth，1999，83(4):622-629.

［11］陳 靜，秦 炯，韓 穎，等.一氧化氮和內質網應激［J］.中國病理生理雜志，2008，24(11):2272-2275.

［12］Chang KS，Davis RF.Propofol produces endotheliumindependent vasodilation and may act as a Ca2+channel blocker［J］.Anesth Analg，1993，76(1):24-32.

［13］Liu Y，Chang H，Niu L，et al.Effects of propofol on responses of rat isolated renal arteriole to vasoactive agents［J］.Vascul Pharmacol，2009，51(2-3):182-189.

［14］Huang Y，Ho IH.Separate activation of intracellular Ca2+release，voltage-dependent and receptor-operated Ca2+channels in the rat aorta［J］.Chin J Physiol，1996，39(1):1-8.