丹紅通精方對自身免疫性慢性前列腺炎大鼠血液及前列腺組織細胞因子水平的影響

黃志洪 ，盧玉忠，李慎果，覃 湛，張兆磊，袁少英*

1.廣州中醫(yī)藥大學附屬廣東省中醫(yī)院珠海醫(yī)院藥劑科，廣東珠海 519015；2.廣州中醫(yī)藥大學，廣東廣州 510405；3.廣州中醫(yī)藥大學附屬廣東省中醫(yī)院珠海醫(yī)院男科，廣東珠海 519015

近年來，慢性前列腺炎發(fā)病率有增高的趨勢，中青年男性發(fā)病率高，且缺乏有效的治療方法和藥物。我院男科根據(jù)多年臨床與實驗研究總結出治療慢性前列腺炎的系列中藥方劑，其中丹紅通精方對氣滯血瘀型前列腺炎療效明顯[1]，為尋找其治療作用的機理，筆者通過丹紅通精方對自身免疫性慢性前列腺炎大鼠血液及前列腺組織中腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素 10（IL-10）水平影響的實驗研究來探討?，F(xiàn)報道如下：

1 材料與方法

1.1 實驗動物

雄性 Wistar大鼠，8～10 周齡，體重 250～300 g，清潔級。

1.2 主要試劑

福氏完全佐劑（FCA）；卡介苗；百白破疫苗；0.5%TritonX 2100（內皮細胞損傷劑）的生理鹽水（自配）；0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液（PBS緩沖液）；乙醚；酶聯(lián)接免疫吸附劑測定（ELISA）試劑盒（北京晶美生物工程有限公司）；RNA抽提劑（Trizol）（美國Invitrogen公司）；氯仿和異丙醇；實時定量PCR擴增儀（Roche公司）；內參照TNF-α、IL-10的陽性模板標準品（上海博亞生物公司）；內參照TNF-α、IL-10的特異性引物（上海生物工程技術公司）；熒光染料SYBR GreenⅠ（Bio-Rad公司）；RNA 提取試劑盒（QIAGEN 公司）；RNA 逆轉錄試劑盒（Invitrogen公司）；DNA聚合酶（大連寶生物工程公司）。

1.3 大鼠前列腺蛋白提純液的制作

取雄性Wistar大鼠10只，處死后再剝取其前列腺組織，加入含0.5%Triton X 2100（內皮細胞損傷劑）的生理鹽水溶液，勻漿離心后，取上清液，用721分光光度計，以牛血清白蛋白溶液為標準蛋白，采用雙縮脲法進行蛋白含量測定，最后用0.1 mol/L PBS緩沖液稀釋為15 mg/ml濃度的溶液。

1.4 福氏完全佐劑（FCA）的制備

將液體石蠟與羊毛脂按2∶1比例，共熱至70℃，混勻，高溫滅菌后按5 mg/ml濃度加入佐劑用卡介苗，無菌乳化后使用。

1.5 丹紅通精方混懸液的制備

丹紅通精方主要由以下方藥組成：丹參1包、桃仁1包、紅花1包、水蛭1包、川牛膝1包、紅景天1包、穿破石1包、失笑散1包、牡蠣1包、黃芪1包，采用江蘇天江藥業(yè)有限公司生產(chǎn)的中藥配方顆粒組成的協(xié)定方劑。丹紅通精方混懸液的制備過程如下：取丹紅通精方1劑，加入100℃開水300 ml，充分溶解方中藥物顆粒，待冷卻備用。

1.6 動物分組及造模

40只大鼠隨機分成空白對照組（n=10）、低劑量實驗組（n=10）、中劑量實驗組（n=10）及高劑量實驗組（n=10）。 除空白對照組外，其他各組均采用下述方法造模：將實驗大鼠采用乙醚麻醉，腹腔注射百白破疫苗0.5 ml，多點皮內注射大鼠前列腺蛋白提純液和FCA乳劑（比例為1∶1的混懸液）1.0 ml?？瞻讓φ战M分別行腹腔及皮內多點注射生理鹽水注射液0.5、1.0 ml。 以上各組均分別于第 0、30 天行第 2 次注射[2]。 第45天可以出現(xiàn)特異性的形態(tài)學與分子生物學改變。

1.7 給藥方法

造模成功1周后，開始按下述劑量給藥：空白對照組給予生理鹽水 10 ml/（kg·d），灌胃，1 次/d；低、中、高劑量實驗組：分別給予丹紅通精方混懸液 5、10、15 ml/（kg·d）灌胃，1次/d。各組均連續(xù)給藥35 d，每日觀察其活動、進食等情況，35 d后處死動物，并進行相關指標的檢測。

1.8 酶聯(lián)接免疫吸附劑測定（ELISA）

末次給藥后24 h，將實驗大鼠采用乙醚麻醉，頸動脈取血，采用雙抗體夾心ELISA法定量分析各組大鼠血清中TNF-α、IL-10的表達，其中，試劑盒的操作嚴格按照說明書進行。

1.9 實時熒光定量RT-PCR

取血后，同時斷頭處死各組大鼠，剝離前列腺并稱重，1/3組織置焦碳酸二乙酯（DEPC）水中漂洗3次，迅速入液氮保存待，提取總RNA。根據(jù)Trizol RNA提取試劑盒說明書提取前列腺組織總RNA及制備cDNA。TNF-α、IL-10 PCR引物根據(jù)相關基因的大鼠cDNA序列進行設計。見表1。

1.10 統(tǒng)計學方法

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件行統(tǒng)計學分析，計量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）表示，各組間比較采用單因素方差分析。計數(shù)資料用率表示，比較采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義，P＜0.01為差異有高度統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠前列腺肉眼觀

未見各組大鼠前列腺形態(tài)，大小，顏色有明顯差別，各組均未發(fā)現(xiàn)前列腺與周圍組織粘連。

表1 PCR引物序列

2.2 各組大鼠前列腺濕重及前列腺指數(shù)的測定

結果表明丹紅通精方對前列腺濕重及前列腺指數(shù)（前列腺濕重/體重比）影響較小，各組統(tǒng)計學分析差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。 見表2。

2.3 TNF-α、IL-10在各組大鼠血清中的水平

ELISA檢測結果顯示，在自身免疫性慢性前列腺炎模型中，給予中、高劑量的丹紅通精方混懸液能導致大鼠血清TNF-α、IL-10蛋白表達明顯高于空白對照組和低劑量實驗組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01 或 P＜0.05）。 見表3。

2.4 TNF-α、IL-10在各組大鼠前列腺組織中的表達情況

實時熒光定量RT-PCR結果表明，在自身免疫性慢性前列腺炎的發(fā)生發(fā)展過程中，前列腺組織中TNF-α、IL-10 mRNA表達量明顯高于正常，且與低劑量實驗組相比較，中、高劑量實驗組大鼠前列腺組織中TNF-α、IL-10 mRNA表達量的升高更明顯。說明丹紅通精方能提高前列腺蛋白提純液誘導的自身免疫性慢性前列腺炎大鼠血清及前列腺組織中TNF-α、IL-10水平，并且與低劑量丹紅通精方實驗組相比較，給予中、高劑量丹紅通精方實驗組的作用更加明顯，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01 或 P＜0.05）。 見表4。

表2 各組大鼠前列腺濕重及前列腺指數(shù)的比較（±s）

表2 各組大鼠前列腺濕重及前列腺指數(shù)的比較（±s）

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表3 各組大鼠血清中TNF-α、IL-10的含量（±s，ng/L）

表3 各組大鼠血清中TNF-α、IL-10的含量（±s，ng/L）

注：與空白對照組比較，▲P<0.05，▲▲P<0.01；與低劑量實驗組比較，*P<0.05，**P<0.01

組別 只數(shù)10101010空白對照組低劑量實驗組中劑量實驗組高劑量實驗組TNF-α 20.18±9.1223.89±8.07111.46±6.71▲*138.52±5.75▲▲**IL-1086.78±30.2594.99±35.02130.17±43.61▲*195.22±56.34▲▲**

表4 各組大鼠前列腺組織中TNF-α、IL-10mRNA的表達情況（±s，ng/L）

表4 各組大鼠前列腺組織中TNF-α、IL-10mRNA的表達情況（±s，ng/L）

注：與空白對照組比較，△P<0.05，△△P<0.01；與低劑量實驗組比較，*P<0.05，**P<0.01

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3 討論

目前慢性前列腺炎的病因和發(fā)病機制仍不清楚，很多學者認為該病與細胞因子密切相關[3]，并對此展開了一系列的研究。丹紅通精方對于治療氣滯血瘀型慢性前列腺炎已卓有成效。本研究中所用的丹紅通精方，方中蒲黃、五靈脂、水蛭、紅景天、黃芪為君藥，其中，蒲黃、五靈脂活血祛瘀，散結止痛，水蛭消瘀血于無形，紅景天既可益氣健脾，又能活血化瘀，黃芪補氣升陽，托毒排膿；紅花、丹參、桃仁為臣藥，可活血止痛；牡蠣軟堅散結、穿破石活血通絡為佐藥；川牛膝引藥下行兼有活血之功為使藥。全方共奏活血化瘀、行氣止痛、扶正益氣之功。

現(xiàn)有文獻[4]表明，調節(jié)性細胞因子、抗炎癥細胞因子、促炎癥細胞因子都參與了前列腺炎的免疫反應，出現(xiàn)了異常的變化，其中具有代表性的是IL-8、IL-10、TNF-α等。慢性前列腺炎實驗組動物前列腺組織中IL-8、IL-10、TNF-α等炎癥因子水平均會有不同程度升高，說明模型動物存在自身免疫后的炎癥反應。在許多由感染引起的慢性前列腺炎病例中，TNF-α可能在隨后的宿主防御中起重要作用，發(fā)揮抗感染效應。在前列腺局部，TNF-α可以激活中性粒細胞和單核巨噬細胞，刺激它們合成IL-1、IL-6、IL-8和TNF，促進炎癥反應[5-6]。IL-10是人類免疫應答中已發(fā)現(xiàn)的最重要的抗炎癥因子，主要由單核巨噬細胞、T和B淋巴細胞產(chǎn)生，是一種多效應的細胞因子。在人類，它抑制單核吞噬細胞、多形核白細胞和嗜酸粒細胞產(chǎn)生促炎癥因子[7]。IL-10水平和神經(jīng)生長因子（NGF）水平成正相關（P<0.05）。NGF被認為是和CP/CPPS的疼痛癥狀有密切關系的因子，是一種神經(jīng)營養(yǎng)素，能夠調節(jié)神經(jīng)對痛覺感受的靈敏度[6]。

從以上實驗結果可見，丹紅通精方能提高自身免疫性前列腺炎大鼠血清及前列腺組織中TNF-α、IL-10水平 （P<0.05或P<0.01），并且中、高劑量給藥組大鼠血清及前列腺組織中TNF-α、IL-10水平升高更明顯（P<0.05或P<0.01）。既往相關研究結合本實驗表明，丹紅通精方對改善自身免疫性前列腺炎具有顯著作用，其機制與提高模型大鼠血液及前列腺組織中TNF-α、IL-10水平有關。

[1]黃志洪,袁少英,覃湛,等.丹紅通精方治療氣滯血瘀型慢性前列腺炎的臨床觀察[J].中國醫(yī)藥導報,2009,6(4):73-75.

[2]周曉輝,韓蕾,周智恒,等.免疫性慢性非細菌性前列腺炎大鼠模型的形態(tài)學與分子生物學特性[J].中華男科學雜志,2005,11(4):290-295.

[3]劉海紅,夏欣一,黃宇烽.慢性前列腺炎與細胞因子研究進展[J].中華男科學雜志,2006,12(6):548-550,554.

[4]王洪志,劉朝東,韋超.TNF-α和IL-10在慢性非細菌性前列腺炎大鼠中的表達及意義[J].重慶醫(yī)科大學學報,2009,34(9):1187-1190.

[5]溫志鵬,洪志明,林星游,等.前列活血湯對自身免疫性前列前列腺內炎性細胞因子的影響[J].世界中西醫(yī)結合雜志,2010,5(5):396-399.

[6]楊世坤,張磊,陳志勇,等.Ⅲ型前列腺炎免疫偏移的研究[J].浙江臨床醫(yī)學,2007,9(3):345-346.

[7]王云鵬.細胞因子與慢性前列腺炎關系的研究現(xiàn)狀[J].臨床誤診誤治,2007,20(9):53-56.