應(yīng)用SELDI技術(shù)與MATLAB軟件預(yù)測替吉奧聯(lián)合欖香烯治療消化道腫瘤敏感性的前瞻性研究

吉利娜，黃 金，陳 妍，裴 毅

山西省腫瘤醫(yī)院老年病科，山西太原 030013

替吉奧是一種氟尿嘧啶衍生物口服抗癌新藥，其單藥治療轉(zhuǎn)移性晚期結(jié)腸、直腸癌有效率可達(dá)35.5%[1]，欖香烯（Elemene）作為中藥溫郁金中提取的抗癌有效成分，目前已發(fā)現(xiàn)其可用于肺癌、晚期消化道腫瘤等實(shí)體腫瘤的治療，其對惡性胸腔積液的局部治療效果也很明顯，具有抗癌譜廣、安全、無毒、與化療聯(lián)合使用可以協(xié)同抗癌的作用。前期研究已發(fā)現(xiàn)能預(yù)測替吉奧治療消化道癌的敏感性指紋[2]，本研究以此為基礎(chǔ)探索替吉奧聯(lián)合欖香烯治療消化道癌敏感性的指紋，現(xiàn)報(bào)道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料

7例經(jīng)術(shù)后病理報(bào)告確診的消化道腫瘤患者均來自我院老年病科，其中，男4例，女3例；年齡52～83歲；其中，大腸癌5例，胰腺癌1例，肝轉(zhuǎn)移1例，腹膜轉(zhuǎn)移1例，合并腹腔積液1例。根據(jù)WHO實(shí)體腫瘤療效評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)將替吉奧聯(lián)合欖香烯治療1個(gè)療程后的患者分成穩(wěn)定組（SD）和無效組（PD）。

1.2 治療方法

所有患者均采用替吉奧聯(lián)合欖香烯治療。替吉奧用法為口服，通常根據(jù)患者的體表面積計(jì)算首次給藥的基準(zhǔn)量，即80～120 mg/（m·2d），2次/d，早飯后和晚飯后各服1次，連服28 d，之后停藥14 d，此為1個(gè)周期，可以反復(fù)進(jìn)行。聯(lián)合欖香烯用法為600 mg加入0.9%氯化鈉注射液內(nèi)靜滴15 d，1次/d，治療期間若病情進(jìn)展或副作用較大不能耐受時(shí)停藥。

1.3 血清蛋白質(zhì)檢測

1.3.1 標(biāo)本采集及處理 治療前取清晨空腹末梢靜脈血3 ml，靜置，3000 r/min離心5 min，分離血清，-80℃冰箱保存。血清標(biāo)本水浴解凍，10000 r/min 離心 2 min，取 5 μl樣品，加 10 μl 9M尿素，振蕩30 min，加180 μl緩沖液稀釋 （100 mmol/L NaOAc，pH 4.0），4℃ 10000 r/min 離心 2 min，取上清待用。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)方法 ①芯片預(yù)處理：將芯片安裝到Bioprocessor上，每孔加 200 μl結(jié)合緩沖液（100 mmol/L NaOAc，pH 4.0），振蕩5 min，拍干，重復(fù)1次；每孔上樣100 μl血清樣品，室溫振蕩1 h，甩去液體；用200 μl結(jié)合緩沖液洗2次，每次5 min，拆下芯片，待芯片自然干燥，每點(diǎn)加SPA（50%乙腈和0.5%三氟乙酸的飽和溶液）0.5 μl 2次，干燥待測。②數(shù)據(jù)收集：用加有All-in-one標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的NP 20芯片校正質(zhì)譜儀，設(shè)定儀器參數(shù)，在Ciphergen Protein Chip軟件中設(shè)定讀片程序讀取芯片數(shù)據(jù)，其中，橫坐標(biāo)為蛋白質(zhì)質(zhì)荷比（M/Z），縱坐標(biāo)為蛋白質(zhì)相對含量（豐度）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

利用蛋白指紋圖譜儀自帶的Biomarker Wizard 3.1軟件對兩組血清有相同質(zhì)荷比的蛋白質(zhì)含量數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得出含量有顯著性差異的蛋白質(zhì)峰，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。用MATLAB 7.0.1軟件對每個(gè)差異蛋白指紋的豐度數(shù)據(jù)進(jìn)行曲線擬合得出相應(yīng)的曲線及曲線方程，觀察每條曲線是否具函數(shù)關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 7例消化道腫瘤患者的基本指紋情況 見圖 1、2。

圖1 7例患者的蛋白質(zhì)譜圖

圖2 7例患者的蛋白模擬電泳圖

2.2 兩組差異蛋白質(zhì)含量情況

設(shè)定參數(shù)分別對兩組所得指紋圖譜進(jìn)行分析，治療穩(wěn)定組和無效組有6處蛋白質(zhì)含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表1。

2.3 差異蛋白質(zhì)組的豐度擬合曲線圖

經(jīng)MATLAB 7.0.1軟件對差異指紋的豐度數(shù)據(jù)進(jìn)行曲線擬合。兩組的差異指紋豐度與療效均呈函數(shù)關(guān)系，其中，M/Z為9277、9555的曲線豐度呈穩(wěn)定的上升趨勢，豐度與療效呈反比例關(guān)系；M/Z 為 4467、7959、15903、15064 的曲線豐度呈穩(wěn)定的下降趨勢，豐度與療效呈正比例關(guān)系。見圖3。

表1 兩組差異蛋白質(zhì)含量情況比較（±s）

表1 兩組差異蛋白質(zhì)含量情況比較（±s）

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3 討論

有研究表明替吉奧反應(yīng)性好，依從性高，與氟尿嘧啶比較其能維持較高的血藥濃度并提高抗癌活性，安全性好。也有研究表明欖香烯對胃癌[3]、肝癌[4]等消化道腫瘤有確切療效，與化療同時(shí)聯(lián)合欖香烯可起到增強(qiáng)抗癌作用、改善帶瘤機(jī)體病理、生理狀態(tài)以及輔助和調(diào)整的作用[5]?？鼓[瘤藥物的治療效果主要取決于藥物的耐藥性[6]，其只能通過治療后影像學(xué)或血清學(xué)指標(biāo)的變化表現(xiàn)出來，但這時(shí)可能已經(jīng)喪失了最佳的治療時(shí)機(jī)。目前，醫(yī)學(xué)研究證明，耐藥的基礎(chǔ)與某種蛋白質(zhì)的含量增多有關(guān)[7]，由于SELDI技術(shù)可以海量捕捉未知蛋白質(zhì)，并以指紋圖形式（峰型及豐度）準(zhǔn)確描述和量化[8]，因此本研究通過比較已知替吉奧聯(lián)合欖香烯治療晚期消化道癌療效的腫瘤患者血清蛋白質(zhì)指紋，捕獲能預(yù)測其療效的血清蛋白質(zhì)指紋。

本研究根據(jù)實(shí)體瘤療效評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)判斷療效并以此分組，所以臨床療效的準(zhǔn)確判斷是本研究的關(guān)鍵。然而目前惡性腫瘤療效的評價(jià)，是以腫塊縮小程度判斷，如穩(wěn)定期（SD）的評價(jià)是腫塊增大與縮小程度均<25%，而在實(shí)際應(yīng)用中25%的判斷是模糊的，從而影響到以療效進(jìn)行分組的分析，因此作為分組的測定值必須進(jìn)行療效函數(shù)曲線擬合，以客觀地界定療效區(qū)間，實(shí)現(xiàn)正確分組。本研究的蛋白質(zhì)指紋在M/Z界定后療效的判斷以豐度確定，作為療效判斷的豐度值呈現(xiàn)函數(shù)關(guān)系，如果這種函數(shù)關(guān)系不存在，說明腫瘤實(shí)際變化與檢測結(jié)果有誤差。因此筆者采用MATLAB軟件先對差異指紋的豐度值進(jìn)行曲線擬合，觀察耐藥蛋白質(zhì)含量與療效是否呈函數(shù)關(guān)系，以確定研究的可行性。

圖3 替吉奧聯(lián)合欖香烯治療消化道腫瘤是否耐藥的標(biāo)識指紋的豐度擬合曲線圖

本研究共選擇7例患者，其中，化療后穩(wěn)定者4例，無效者3例。圖1、2為研究對象的基本指紋情況，經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析后，M/Z 為 4467、7959、9277、9555、15903、15064 的蛋白 質(zhì) 指 紋在兩組間存在明顯差異。圖3為6個(gè)差異指紋的擬合曲線，可以看出穩(wěn)定組和無效組的差異指紋（質(zhì)荷比）與療效均呈函數(shù)關(guān)系，其中M/Z為9277、9555的曲線豐度呈穩(wěn)定的上升趨勢，豐度與療效呈反比例關(guān)系；M/Z為4467、7959、15903、15064的曲線豐度呈穩(wěn)定的下降趨勢，豐度與療效呈正比例關(guān)系。本研究借助于MATLAB 7.0.1軟件對每個(gè)差異指紋的豐度數(shù)據(jù)進(jìn)行曲線擬合得出相應(yīng)的擬合曲線均呈有意義的線性函數(shù)關(guān)系，因此采用SELDI技術(shù)得出的差異指紋豐度高低和消化道癌患者療效的函數(shù)關(guān)系是存在的。

綜上所述，經(jīng)SELDI技術(shù)檢查，指紋圖譜M/Z為4467、7959、9277、9555、15903、15064 為預(yù)測替吉奧聯(lián)合欖香烯治療消化道癌敏感性的指紋標(biāo)識。其中，M/Z 9277、9555為低表達(dá)，M/Z 4467、7959、15903、15064 為高表達(dá)， 為預(yù)測替吉奧聯(lián)合欖香烯治療消化道癌獲得了穩(wěn)定的標(biāo)識指紋。下一步的研究應(yīng)是對有價(jià)值的指紋豐度做進(jìn)一步驗(yàn)證，獲取療效標(biāo)準(zhǔn)界定值，使之更好的服務(wù)臨床。

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