植物AGAMOUS基因調(diào)控機(jī)制研究進(jìn)展

徐雷，王利琳

(1.江蘇新天地生物肥料工程中心有限公司，江蘇無錫214200;2.杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，浙江杭州310036)

20世紀(jì)90年代，Coen和Meyerowitz對(duì)擬南芥和金魚草花器官突變體(主要是MADS-box轉(zhuǎn)錄因子的代表性突變體)進(jìn)行遺傳分析，提出了花器官形態(tài)建成的粗糙的“ABC模型”，后來經(jīng)過眾多學(xué)者的修改和補(bǔ)充，該模型發(fā)展為“ABCDE”模型。其中，C功能基因AGAMOUS(AG)在花器官發(fā)育中扮演著重要的角色，對(duì)果實(shí)和種子的形成也至關(guān)重要?；òl(fā)育調(diào)控基因的上下游基因及其功能是目前植物發(fā)育遺傳學(xué)的研究熱點(diǎn)之一，AG基因是最早被克隆的花發(fā)育調(diào)控基因，其上下游基因及其功能研究更是其中的熱點(diǎn)，明確其作用分子機(jī)制對(duì)于農(nóng)藝、園藝和基因控制技術(shù)具有重要的價(jià)值。

1990年，Yanofsky等在擬南芥中首次克隆了花同源異型基因AG。在擬南芥中，AG與APETALA1(AP1)基因、APETALA2(AP2)基因相互拮抗，同時(shí)AG還與WUSCHEL(WUS)相拮抗，終止WUS的花分生組織指定，它還是第4輪花器官發(fā)育的指定基因。在胚珠的發(fā)育中，AG也發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。在其他一些物種中，AG同源基因相對(duì)保守，但是部分發(fā)生了復(fù)制，而且彼此功能冗余。雖然目前對(duì)AG基因已進(jìn)行了較多的研究，但是對(duì)于在花發(fā)育調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中，AG的上下游基因及其作用的分子機(jī)制，目前還沒有文章進(jìn)行綜述。

1 AG序列分析及特征

AG早在裸子植物和被子植物分化之前就已經(jīng)出現(xiàn)，并且在隨后3億年的進(jìn)化過程中功能保守[1]。目前已有20多種植物(包括裸子植物和被子植物)的AG同源基因被克隆。序列分析和基因表達(dá)研究也表明，盡管這些基因在序列上有差異，但功能相近[2]。

AG基因序列分為5個(gè)區(qū)域，從5’端開始依次命名為N末端、M區(qū)(編碼約57個(gè)氨基酸的MADS-box區(qū))、I區(qū)(Intervening region)、K區(qū)和C末端。M區(qū)高度保守，I區(qū)和K區(qū)相對(duì)保守，C末端特異性較強(qiáng)。其編碼285個(gè)氨基酸的轉(zhuǎn)錄因子，含有9個(gè)外顯子，8個(gè)內(nèi)含子。

AG亞家族的C類基因(通過進(jìn)化樹分析，所有AGAMOUS-LIKE基因分為3類:C類、D類(基于該進(jìn)化枝含有矮牽牛FBP7和FBP11)、裸子植物類)，在C末端具有2個(gè)相對(duì)保守的區(qū)域，被稱為AGⅠ區(qū)和AGⅡ區(qū)[3]。本研究通過對(duì)最近發(fā)布的豆目植物AG序列豌豆AG同源基因PsAG[4]、百脈根LjAGa和LjAGb[1]進(jìn)行軟件預(yù)測氨基酸序列比對(duì)，也發(fā)現(xiàn)這2個(gè)相對(duì)保守區(qū)的存在(圖1)。結(jié)合高志紅等[2]的判斷，可以驗(yàn)證此為AG同源基因的特征之一。

圖1 PsAG、LjAGa、LjAGb、AG蛋白預(yù)測氨基酸序列比對(duì)

2 擬南芥AG分子作用機(jī)制

自從1990年在擬南芥中克隆到AG之后，至今，對(duì)花發(fā)育及控制花形態(tài)建成的分子遺傳機(jī)制的研究取得了很多的進(jìn)展，主要都是建立在對(duì)擬南芥研究的基礎(chǔ)之上。擬南芥花自外向內(nèi)，第1輪為萼片，第2輪為花瓣，第3輪為雄蕊，第4輪為心皮。

2.1 擬南芥AG時(shí)空表達(dá)模式

在擬南芥野生型花中，AG mRNA和蛋白在花發(fā)育第3階段，花的第3、4輪檢測到[5]。AG表達(dá)的時(shí)空性保證了花器官屬性，花器官數(shù)量和模式的正確[6]。

2.2 擬南芥AG功能

目前公認(rèn)AG至少具有4個(gè)功能:抑制A功能基因;終止花分生組織;指定雄蕊和心皮屬性;調(diào)控胚珠的發(fā)育。AG的正確表達(dá)需要第2個(gè)內(nèi)含子，它有3 kb大小，含有2個(gè)CArG-box[7]，是調(diào)控蛋白的目標(biāo)序列[7－8]，如正調(diào)控蛋白LFY、WUS，負(fù)調(diào)控蛋白LUG、SEU、BLR、AP2等。

2.3 擬南芥AG與上下游基因分子作用機(jī)制

在花發(fā)育調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中，AG與眾多基因相互作用。在不同的途徑中，其位置處于相對(duì)的上游或下游，這是復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)所導(dǎo)致的。在此，每個(gè)作用途徑中，我們分別加以闡述(圖2)。

圖2 AG上下游作用基因及其功能(箭頭為正調(diào)控，短線為負(fù)調(diào)控)

AP1和AP2抑制AG在第1、2輪的表達(dá)，而AG也抑制它們?cè)诘?、4輪的表達(dá)。對(duì)于AP1，是由SEUSS(SEU)或SEUSS-like

(SLK)蛋白作為銜接蛋白把LEUNIG(LUG)蛋白與AP1蛋白和SEP3蛋白結(jié)合，構(gòu)成復(fù)合體，直接結(jié)合AG第2個(gè)內(nèi)含子，抑制AG在第1、2輪的表達(dá)。LEUNIG-HOMOGOG(LUH)是LUG的旁系同源基因，LUH蛋白也是與SEU蛋白組成復(fù)合體，抑制AG的表達(dá)。在負(fù)調(diào)控AG時(shí)，LUG比LUH更重要[7，9－10]。在環(huán)境脅迫條件下，LUG和LUH功能有所不同[10]。

LFY蛋白是AG表達(dá)的直接激活子[11]，但其本身還不足以誘導(dǎo)AG，需要其他的因子輔助，可能是WUS[11]。酵母實(shí)驗(yàn)顯示，LFY和WUS分別獨(dú)立地結(jié)合AG第2個(gè)內(nèi)含子的不同區(qū)域[12]，但是AG的轉(zhuǎn)錄只有在WUS和LFY同時(shí)存在時(shí)，才被激活[13]。WUS和LFY之間作用部分冗余，因?yàn)閃US的過表達(dá)能夠減少AG激活時(shí)對(duì)LFY的需求，而且wus和lfy突變體顯示出累加的表型[12]。至于WUS和LFY兩者之間如何相互作用，還不清楚。WUS是終止花分生組織的關(guān)鍵且明確的調(diào)節(jié)開關(guān)[11]。WUS激活A(yù)G，而AG表達(dá)后以非直接的方式抑制WUS[13]，這樣產(chǎn)生一個(gè)負(fù)反饋環(huán)，以調(diào)節(jié)細(xì)胞增生與花分生組織的分化[12]。AG雖然沒有影響WUS表達(dá)區(qū)域，但是在約第7階段，心皮原基形成時(shí)，AG達(dá)到足夠的水平，關(guān)閉了WUS的表達(dá)[11，14]，以終止花分生組織。除了AG，WUS也受到CLV途徑的負(fù)調(diào)控。AG和CLV途徑主要是獨(dú)立發(fā)揮功能，因?yàn)閍g和clv1突變體在分生組織決定上的效果是累加的[12－13]。

BELLRINGER(BLR即PENNYW ISE(PNY))編碼一個(gè)BELL同源結(jié)構(gòu)域蛋白，BLR蛋白直接結(jié)合到AG的第2內(nèi)含子，抑制AG表達(dá)。blr突變體老的莖終端花中萼片轉(zhuǎn)變?yōu)樾钠8]。

HUA和HEN基因可能在AG RNA加工中發(fā)揮功能，在花發(fā)育后期維持AG的表達(dá)。HUA1蛋白類似CCCH鋅指蛋白，能結(jié)合單鏈RNA和DNA;HUA2蛋白含有核定位信號(hào)，有轉(zhuǎn)錄激活活性。HUA ENHANCER 1(HEN1)蛋白是個(gè)核蛋白，是microRNA積聚所需要的;HEN2蛋白類似DexH-box RNA解旋酶，有核定位信號(hào)，可能是核酸外切酶的一個(gè)成分，它還參與了AG mRNA前體的加工[15]。HEN4蛋白含有KH結(jié)構(gòu)域，是RNA結(jié)合蛋白，與HUA1蛋白定位相同并且相互作用，在營養(yǎng)器官發(fā)育中也發(fā)揮作用[15]。HEN4，HUA1和HUA2可能阻止了發(fā)生在AG第2個(gè)內(nèi)含子內(nèi)的轉(zhuǎn)錄提前終止，通過利于AG mRNA前體的加工來發(fā)揮在花生殖器官屬性和花分生組織終止指定中的作用[15]。另外，HUA1，HUA2，HEN1功能冗余地維持B類功能基因的表達(dá)，它們也在營養(yǎng)器官發(fā)育中發(fā)揮作用[16]。

上述基因主要作為相對(duì)的AG上游基因發(fā)揮作用，調(diào)控AG的時(shí)空表達(dá)模式或調(diào)控其表達(dá)量，以此為基礎(chǔ)，AG再發(fā)揮相應(yīng)的功能。LFY和WUS促進(jìn)AG表達(dá)，AP1和AP2調(diào)控其限于心皮和雄蕊中表達(dá)，HUA和HEN則負(fù)責(zé)調(diào)控AG的正確轉(zhuǎn)錄和加工。在花發(fā)育后期，BLR調(diào)控莖終端花中AG的表達(dá)部位;而HUA和HEN維持其表達(dá)。

AG調(diào)控著下游約1 000個(gè)基因的表達(dá)[17]。其中已確定AG蛋白直接與AG、AP3、CRC、SEP3、DAD1和GA4啟動(dòng)子CArG-box結(jié)合，促進(jìn)其表達(dá)[18－19]。其中，AG通過調(diào)控GA4的表達(dá)，促進(jìn)GA的生物合成[18]，以對(duì)GA開花誘導(dǎo)途徑提供反饋。

AG主要通過調(diào)控SPL和DAD1，調(diào)控雄蕊的形態(tài)建成。

AG調(diào)控SPL的表達(dá)，誘導(dǎo)小孢子產(chǎn)生，形成花粉。在花發(fā)育第5～6階段，AG足以激活SPL發(fā)揮功能[17]，但是并不參與維持其表達(dá)[20]。另外，還有其他的輪特異因子參與小孢子發(fā)生的誘導(dǎo)[20]。

在花發(fā)育后期階段，AG是花藥形成和分裂以及花絲的建成和延長所必需的[17]。DEFECTIVE IN ANTHER DEHISCENCE1(DAD1)編碼茉莉酸生物合成起始步驟的催化酶，在花發(fā)育后期，AG蛋白結(jié)合到DAD15’編碼區(qū)中10 bp的CArG區(qū)，上調(diào)DAD1在雄蕊中的表達(dá)[17]，而茉莉酸控制著雄蕊的成熟，這樣，AG通過控制茉莉酸的合成起始，從而協(xié)調(diào)雄蕊的成熟。DAD1還受到AUXIN RESPONSE FACTOR 6(ARF6)和AUXIN RESPONSE FACTOR 8(ARF8)的正調(diào)控，通過茉莉酸途徑，控制著內(nèi)三輪花器官的長度，影響花的開放[21]。

AG通過調(diào)控SPT、CRC、GIK、KNU等基因，調(diào)控心皮的形態(tài)建成。

SPATULA(SPT)編碼螺旋—環(huán)—螺旋轉(zhuǎn)錄因子，控制著心皮邊緣和傳導(dǎo)管(the transmitting tract)的細(xì)胞增殖[18]。它的表達(dá)可能同時(shí)受到AG和SHP的冗余調(diào)控[22]。

CRABSCLAW(CRC)表達(dá)于心皮的遠(yuǎn)軸部位，參與到心皮原基遠(yuǎn)軸組織(如外部表皮組織)的發(fā)育[18]，也涉及雌蕊和蜜腺的指定[19]。CRC可以在AG不存在的情況下，指導(dǎo)心皮發(fā)育，但是AG可以強(qiáng)化其表達(dá)。CRC也可以激活A(yù)G[18]。

AG直接結(jié)合到GIK下游732bp的CArG box，上調(diào)它的表達(dá)。GIANT KILLER(GIK)編碼一個(gè)AT-hook類型的DNA結(jié)合蛋白，AT-hook基序結(jié)合目標(biāo)DNA序列核基質(zhì)附著區(qū)(Matrix attachment regions，MARs)的DNA雙螺旋的小溝，不同于通常的轉(zhuǎn)錄因子主要結(jié)合大溝。植物中，對(duì)AT-hook基序蛋白在發(fā)育中的作用了解還很少[19]。GIK蛋白持續(xù)結(jié)合到ETT的MARs，負(fù)調(diào)控ETT的表達(dá)，而且這種抑制與ETT啟動(dòng)子中H3K9的二甲基化的動(dòng)態(tài)變化密切相連。在體外，GIK直接結(jié)合到CRC、JAG和KNU的MARs，抑制它們的轉(zhuǎn)錄，在體內(nèi)，gik突變體中，JAG和KNU的mRNA水平相對(duì)較高，CRC輕微增加[19]。ETTIN(ETT，AUXIN RESPONSE FACTOR3)與AUXIN RESPONSE FACTOR 4(ARF4)作用冗余，參與花分生組織和生殖器官的近遠(yuǎn)軸模式，以及雌蕊的頂基軸模式建成[19]。JAGGED(JAD)、KNUCKLES(KNU)和NUBBIN(NUB)編碼C2H2鋅指轉(zhuǎn)錄因子，作用冗余地促進(jìn)雄蕊和心皮原基的增生[19]。KNU涉及花分生組織的決定和配子體的指定，它在分生組織的表達(dá)直接受到AG的調(diào)控[19]。AG參與胚珠的發(fā)育，此結(jié)論最初來自于ap2單突變與ap2 ag雙突變的比較。在ap2單突變體中，花瓣大部分缺失，萼片轉(zhuǎn)變成心皮結(jié)構(gòu)，在上面有胚珠形成，其中一些轉(zhuǎn)變成心皮化的結(jié)構(gòu)。而ap2 ag雙突變體中，萼片也表現(xiàn)心皮屬性，但是胚珠轉(zhuǎn)變成心皮結(jié)構(gòu)，數(shù)目顯著增加，這暗示著AG也參與胚珠的指定[23]。其作用的分子機(jī)制可能是由于SHP1，SHP2，STK同時(shí)受到AG的調(diào)控，而它們控制胚珠的發(fā)育。在心皮中，AG蛋白和SEP蛋白可能與STK或SHP蛋白之一組成穩(wěn)定的復(fù)合體促進(jìn)胚珠發(fā)育，同時(shí)這些復(fù)合體中任何一個(gè)可能都足夠促進(jìn)心皮發(fā)育[24]。

在擬南芥中，胚珠作為新的分生組織從心皮組織中形成。WUS在珠心中表達(dá)，類似在莖頂端和花分生組織中的作用方式，以非細(xì)胞自主的形式，控制胚珠原基中細(xì)胞增生[23]。隨后，增生細(xì)胞命運(yùn)由胚珠屬性因子所指定，如同源異形因子BELL1(BEL1)和MADS-box家族成員SEEDSTICK(STK)、SHATTERPROOF1(SHP1)、SHP2及AG[23]，而WUS的表達(dá)再次受到AG和SEP3蛋白的抑制[5]，BEL1可能在蛋白質(zhì)水平負(fù)調(diào)控AG并且維持WUS的抑制狀態(tài)[23]。對(duì)于胚珠中，WUS短暫的表達(dá)起始，其調(diào)節(jié)機(jī)制現(xiàn)在還不了解。

通過酵母三雜交和遺傳分析，Brambilla等[23]發(fā)現(xiàn)SHP1、SHP2、STK和AG分別與SEP蛋白形成二聚體后和BEL1相互作用，控制珠被的屬性和形成。

FRUITFULL(FUL)也與心皮發(fā)育有關(guān)，參與調(diào)控受精后心皮瓣(valve)細(xì)胞分化和增大，可能與SHP相互拮抗[25]。

SEP蛋白在AG發(fā)揮功能時(shí)，也具有重要的作用。SEP蛋白能夠建立促進(jìn)心皮和胚珠發(fā)育的蛋白間的相互作用，沒有足夠的SEP活性，胚珠發(fā)育中的主要基因無法發(fā)揮功能[24]。其中，在促進(jìn)心皮發(fā)育時(shí)，SEP3比SEP1、SEP2更有效，而AG直接促進(jìn)SEP3的表達(dá)[24]，這也有利于自身功能的發(fā)揮。

AG在不同的時(shí)期發(fā)揮不同的功能(圖3)。目前對(duì)A調(diào)控花藥和花絲形態(tài)建成時(shí)的目標(biāo)基因還不明確，對(duì)AG調(diào)控胚珠發(fā)育的作用時(shí)期也不明確，這些還有待進(jìn)一步的深入研究。

圖3 AG主要作用時(shí)間

3 其他植物中AG基因

目前已經(jīng)克隆了20多種植物的AG同源基因，其中部分出現(xiàn)了復(fù)制，如百脈根中，它們的表達(dá)模式也發(fā)生了變化，其功能還有待進(jìn)一步的研究。而同樣的豆目植物豌豆中，我們通過豌豆早褐病毒對(duì)PsAG的保守序列進(jìn)行沉默，發(fā)現(xiàn)在豌豆中也出現(xiàn)了復(fù)制，但是功能相對(duì)保守[26]。

在其他植物中，AG花器官屬性指定和花分生組織決定功能，通常不是由單個(gè)的AG同源基因來發(fā)揮的。在玉米中，這些功能由不同的AG旁系同源基因來執(zhí)行。在擬南芥中，這2個(gè)功能也是可分的，如在擬南芥反義RNA或弱突變(如ag-4，它產(chǎn)生一個(gè)內(nèi)部缺失的AG蛋白)造成的部分AG缺失的植株中就會(huì)出現(xiàn)分生組織不終止，但是器官屬性正常，即花內(nèi)生花的現(xiàn)象。如此表明器官屬性功能并不明顯地與分生組織終止功能重疊。我們通過豌豆早褐病毒，在豌豆中，對(duì)PsAG保守序列進(jìn)行沉默時(shí)，也發(fā)現(xiàn)了這樣的現(xiàn)象。

在裸子植物中，AG同源物與孢子葉球的發(fā)育的聯(lián)系，表明AG在生殖器官屬性指定中的角色是古老的，但是同時(shí)它也提示這些孢子葉球是決定的，即其分生組織是終止的。

ag突變體中外圍花器官數(shù)目增加，但是在玫瑰中，花瓣和雄蕊的增加和最終的花分生組織的終止也可以由花分生組織的定點(diǎn)增大而引起，就像在sup和ult突變體中所見[13]。所以現(xiàn)在對(duì)這一結(jié)果，還不能肯定的歸為AG的一個(gè)功能。

4 展望

AG基因在植物花器官的發(fā)育中占有重要位置，與植物的繁殖息息相關(guān)，在植物的進(jìn)化過程中，其功能相對(duì)保守，沒有發(fā)生較大的變化。

目前確定的4個(gè)AG功能，彼此關(guān)聯(lián)，共同起到調(diào)控花正常發(fā)育的作用。但是對(duì)這些功能發(fā)揮的途徑，了解還不多，其下游基因開發(fā)較少，還有許多基因有待確定，比如雄蕊形態(tài)建成的啟動(dòng)基因還不清楚。隨著更多下游基因的確定，才能更清晰地認(rèn)識(shí)植物花器官的發(fā)育調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，對(duì)于植物花器官改造具有重要意義，具有重要的園藝價(jià)值。

利用AG的功能來控制外來物種入侵具有重要意義。目前對(duì)AG功能的研究已經(jīng)成功拓展應(yīng)用到基因控制技術(shù)中，Liu等[27]把AG第2個(gè)內(nèi)含子與白喉毒素A片段(Diphtheria toxin A，DT-A)的基因相融合，發(fā)現(xiàn)超過89%轉(zhuǎn)基因擬南芥雄蕊和心皮消除，完全不育。

由于AG基因位于調(diào)控植物果實(shí)和種子發(fā)育的基因上游，明確其不同的調(diào)控途徑，無疑對(duì)于作物的育種或果樹的掛果研究具有參考價(jià)值。

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