瀕危樹種金錢松RAPD體系的建立和遺傳多樣性分析

高燕會(huì)，樊民亮，駱文堅(jiān)，黃華宏，童再康

（1.浙江農(nóng)林大學(xué) 生物技術(shù)研究所，浙江 臨安 311300；2.浙江省林業(yè)種苗管理總站，浙江 杭州 310020）

金錢松Pseudolarix amabilis又名金松，是中國特有的單種屬植物。地質(zhì)年代的白惡紀(jì)金錢松曾經(jīng)在亞洲、歐洲、美洲都有分布，更新世的冰河時(shí)代各地金錢松都相繼滅絕，唯有中國長江中下游殘留少數(shù)，成為現(xiàn)今僅存于中國的單屬單種特有的植物［1－4］。由于其特殊的分類地位，金錢松在裸子植物松科Pinaceae系統(tǒng)發(fā)育、古生態(tài)和古氣候的研究方面具有重要意義。這一寶貴的植物遺產(chǎn)被中國定為國家二級(jí)保護(hù)植物，分布于江蘇、安徽、浙江、江西、湖南等地，喜光愛肥，適宜酸性土壤。金錢松樹干通直，材性優(yōu)良，紋理直，耐水濕，可供建筑、橋梁、船舶及家具等用材，而且樹形優(yōu)美，秋季葉呈金黃色，是優(yōu)良的綠化和庭院觀賞樹種。種子可榨油，樹皮和根皮（中藥名為土槿皮或土荊皮）有止癢殺蟲的功能，外用于治療手腳癬、神經(jīng)性皮炎、濕疹［5－6］等。目前，國內(nèi)外對(duì)金錢松的研究多集中在生物學(xué)和生理學(xué)特征方面［7］，例如葉表皮的掃描電鏡觀察［8］、 種子品質(zhì)［9］、 栽培繁殖技術(shù)［10－11］、 生長情況［11］、 化學(xué)成分研究［12］。也有研究金錢松細(xì)胞分類學(xué)的報(bào)道，認(rèn)為根據(jù)其核型分析，應(yīng)該單獨(dú)建立一個(gè)金錢松亞科［13－14］。零星的還有組織培養(yǎng)［15］的報(bào)道。而對(duì)金錢松遺傳多樣性的研究報(bào)道較少。隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（radom amplified polymorphic DNA，RAPD）分子標(biāo)記技術(shù)操作簡(jiǎn)單易行，具有多態(tài)性高，無需活材料，能實(shí)現(xiàn)全基因組無偏取樣和無組織特異性等，在瀕危植物遺傳變異方面有較為廣泛的應(yīng)用［16－18］。此外，還廣泛地應(yīng)用于松類植物遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)的研究中，如多脂松Pinus resinosa，歐洲赤松Pinus sylvestris，輻射松 Pinusradiata，紅松 Pinuskoraiensis，黃山松 Pinustaiwanensis，馬尾松 Pinusmassoniana 等樹種［19－24］。本研究采用RAPD分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)浙江省內(nèi)不同來源的金錢松遺傳多樣性進(jìn)行研究，旨在為合理地保護(hù)、利用與開發(fā)金錢松遺傳資源提供可靠的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料采自浙江省安吉縣靈峰寺林場(chǎng)，共9個(gè)來自金錢松天然林的62個(gè)單株（表1），采集葉芽，于－70℃的低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 金錢松基因組DNA的提取 金錢松基因組DNA的提取采用十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）-硅珠法［25］。

1.2.2 金錢松隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RAPD-PCR）擴(kuò)增體系的建立［25－27］針對(duì)Taq DNA聚合酶量，鎂離子（Mg2+），模板DNA，三磷酸堿基脫氧核苷酸（dNTPs）和引物，采用5因子4水平的正交設(shè)計(jì)L16（45）設(shè)計(jì)方案詳（表2）進(jìn)行試驗(yàn)，共16個(gè)處理，重復(fù)2次·處理－1，在Gene Amp PCR System 9700擴(kuò)增儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增。RAPD-PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)?4℃預(yù)變性4 min，38個(gè)PCR循環(huán)（94℃變性30 s，38℃退火30 s，72℃延伸2 min），72℃延伸7 min。擴(kuò)增的反應(yīng)產(chǎn)物用10.0 g·kg－1的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，于Gel Doc XR凝膠成像系統(tǒng)拍照分析。

表1 供試材料編號(hào)及其來源Table 1 Code and source of the materials investigated

表2 PCR擴(kuò)增體系各成分因素-水平正交設(shè)計(jì)表L16（45）Table 2 Orthoronal design for PCR

1.2.3 不同退火溫度的梯度試驗(yàn) 用以上處理?xiàng)l件所得到的最佳反應(yīng)體系進(jìn)行退火溫度梯度試驗(yàn)，設(shè)置退火溫度。在PCR Express（HyBAID）擴(kuò)增儀上自動(dòng)生成12個(gè)溫度梯度：30.0，30.3，30.9，31.8，32.9，34.7，35.5，36.9，38.4，39.3，39.8，40.1℃，比較退火溫度對(duì)電泳譜帶的清晰度和數(shù)量的影響，從而確定最佳退火溫度。

1.2.4 引物篩選 引物篩選包括初篩和復(fù)篩。用1個(gè)樣品對(duì)200個(gè)隨機(jī)引物進(jìn)行初篩，選擇譜帶清晰的引物用于復(fù)篩。復(fù)篩時(shí)用4個(gè)不同種源各1個(gè)樣品進(jìn)行擴(kuò)增，選擇出清晰、多態(tài)性較高的引物用于RAPD-PCR擴(kuò)增。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 對(duì)金錢松62個(gè)單株進(jìn)行RAPD-PCR擴(kuò)增的電泳譜帶總條數(shù)和多態(tài)性條帶進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。根據(jù)分子標(biāo)記在相同電泳遷移率的有無統(tǒng)計(jì)得到所有位點(diǎn)的二元數(shù)據(jù)；有DNA擴(kuò)增有帶記為1，無帶記為0，強(qiáng)帶和可分辨的弱帶賦值為1。擴(kuò)增條帶與標(biāo)準(zhǔn)分子量的遷移率相比對(duì)照，相同引物擴(kuò)增出來的同一長度（同一電泳遷移率）的帶視為同一位點(diǎn)。將得到的二元數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 16.0軟件進(jìn)行分析，并計(jì)算其歐氏遺傳距離，按Average Linkage對(duì)金錢松種質(zhì)資源進(jìn)行聚類分析，建立聚類樹狀圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 金錢松RAPD-PCR最佳反應(yīng)體系的建立

2.1.1正交試驗(yàn)的直觀分析 根據(jù)本試驗(yàn)的正交設(shè)計(jì)進(jìn)行PCR的擴(kuò)增結(jié)果和電泳檢測(cè)，依據(jù)瓊脂糖電泳條帶的強(qiáng)弱和雜帶的多少做直觀分析。正交試驗(yàn)設(shè)PCR擴(kuò)增結(jié)果是由鎂離子（Mg2+），dNTPs，引物，Taq DNA聚合酶和模板DNA等因素綜合作用的結(jié)果，因而擴(kuò)增結(jié)果存在明顯差異。第1，2，3，4組合譜帶較弱，其原因可能是由于TaqDNA聚合酶的濃度太低而引起的；由于TaqDNA聚合酶的濃度一定時(shí)，鎂離子（Mg2+）濃度的過低（第5，6，9，10組合擴(kuò)增不出條帶），而鎂離子（Mg2+）濃度過高（第8組合擴(kuò)增條帶拖尾且模糊）會(huì)影響擴(kuò)增的效果，第7組合條帶清晰且多態(tài)性高；當(dāng)Taq DNA聚合酶和鎂離子（Mg2+）濃度濃度升高時(shí)，會(huì)擴(kuò)增出非特異性條帶（如第11，12組合）。通過多因素綜合比較選擇第7組合（1.0 × 16.67 nkat TaqDNA 聚合酶，2.5 mmol·L－1鎂離子（Mg2+），50 ng 模板DNA，0.1 mmol·L－1dNTPs，0.5 μmol·L－1引物）擴(kuò)增的譜帶不但多態(tài)性好，重復(fù)性好，且譜帶清晰，是金錢松RAPD-PCR擴(kuò)增的最佳反應(yīng)體系。

2.1.2 金錢松RAPD-PCR最佳退火溫度的確定 退火溫度是影響PCR的重要因素之一。退火溫度不僅與引物序列有關(guān)，還與物種DNA的序列密切相關(guān)［28］，因此，確定最佳退火溫度對(duì)獲得穩(wěn)定可靠的ISSRPCR結(jié)果非常重要。金錢松RAPD-PCR溫度梯度PCR的電泳結(jié)果見圖1，在12個(gè)溫度梯度下30.0，30.3，30.9，31.8，32.9和34.7℃擴(kuò)增的條帶較弱，不能正確地表達(dá)其引物的多態(tài)性，35.5，36.9和38.4℃引物擴(kuò)增出清晰明亮的RAPD條帶。39.3，39.8和40.1℃溫度過高時(shí)，擴(kuò)增出的條帶有拖尾，所以退火溫度過高或過低都會(huì)影響到PCR擴(kuò)增條帶的清晰度和多態(tài)性的正確表達(dá)，綜合多方面的因素，最終選擇38.0℃為金錢松RAPD-PCR擴(kuò)增最適宜的退火溫度。

2.2 擴(kuò)增產(chǎn)物的多態(tài)性分析

通過初篩和復(fù)篩共得到的18條多態(tài)性引物（表3），18條RAPD引物對(duì)62個(gè)供試材料進(jìn)行RAPD-PCR擴(kuò)增，共擴(kuò)增出172條帶，其中170條帶具有遺傳多態(tài)性，多態(tài)性比率為99.2%。在62個(gè)供試材料中，不同RAPD引物的總位點(diǎn)差異較大，從3～20條不等，平均為9.56條，擴(kuò)增出的DNA片段大小分布為200～3 000 bp；其中擴(kuò)增條帶數(shù)最多的為引物S53，共擴(kuò)增出20條帶，說明不同引物與供試材料總DNA部分區(qū)域的同源性有較大差異?？梢哉f明：金錢松種子園群體內(nèi)的DNA多態(tài)性是很豐富的，遺傳變異幅度很大，可能與野生類群分布大范圍較廣，分布區(qū)內(nèi)環(huán)境復(fù)雜多樣有關(guān)，也可能同其復(fù)雜的遺傳背景與起源有關(guān)，因而這些豐富的變異類型為選育觀賞新品種奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。

圖1 正交試驗(yàn)PCR產(chǎn)物電泳圖Figure 1 Theelectrophoresis map of PCR products of the orthogonal tests

表3 18個(gè)引物擴(kuò)增出DNA片段數(shù)Table 3 DNA fragments amplified with 18 primers

2.3 聚類分析

將18條引物擴(kuò)增后得到的二元數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 16.0軟件進(jìn)行分析，對(duì)供試材料根據(jù)RAPD標(biāo)記歐氏遺傳距離，按Average Linkage對(duì)62份金錢松種質(zhì)資源進(jìn)行聚類分析，建立聚類樹狀圖（圖2）。由圖2中以看出，利用RAPD分子標(biāo)記的結(jié)果可以將62份金錢松種質(zhì)資源聚為三大類群：第一大類群是包括由采集于安吉大、安吉三川林場(chǎng)、安吉章村、安吉大溪以及安吉姚村的不同材料，第二大類包括采自長興、臨安以及嘉興的材料，第三大類包括采自安吉上市鄉(xiāng)的材料，其中，同一來源的材料幾乎都聚在一起，說明金錢松天然群體RAPD的多態(tài)性分類和金錢松的地理分布有一定的關(guān)系。但也有例外，如來自臨安野生種群的17號(hào)和來自長興野生種群的16號(hào)就分別和來自安吉大的野生種群聚在一起，可能是遺傳變異的結(jié)果；來自安吉大溪的39號(hào)較為特殊，與其他個(gè)體的遺傳距離為0.280 0～1.255 7，表明金錢松天然種群內(nèi)存在較高的的遺傳多樣性。

3 討論

3.1 金錢松遺傳多樣性分析

遺傳多樣性是指種內(nèi)基因的變化，包括種內(nèi)不同的種群間和同一種群內(nèi)個(gè)體的遺傳變異，種內(nèi)多樣性是物種及以上各水平多樣性的最重要來源。遺傳變異、生活史特點(diǎn)、種群動(dòng)態(tài)及其遺傳結(jié)構(gòu)等決定或影響著一個(gè)物種與其他物種及其環(huán)境相互作用的方式，而且種內(nèi)的多樣性是一個(gè)物種對(duì)人類影響進(jìn)行反應(yīng)的決定因素。種內(nèi)的遺傳多樣性多發(fā)生在分子水平，并且都與核酸的理化性質(zhì)緊密相關(guān)，新的變異是突變的結(jié)果［29］。

瀕危植物的遺傳多樣性水平一般較低。本研究通過RAPD技術(shù)研究了浙江省內(nèi)的金錢松的多態(tài)性位點(diǎn)的比率是99.2%，這一結(jié)果表明：分布于浙江省的金錢松居群具有較為豐富的種內(nèi)遺傳多樣性，這與劉建鋒等［16－17］對(duì)瀕危植物崖柏Thuja sutchuenensis的遺傳多樣性的研究結(jié)論相一致：瀕危植物遺傳多樣性具有一定的變化范圍。說明并非所有的珍稀瀕危植物都存在低水平的遺傳多樣性。

本研究通過RAPD分子標(biāo)記得到的金錢松的聚類圖中，同一來源的材料幾乎都聚在一起，但也有個(gè)別的材料和其地理分布并不完全相同，如來自臨安的17號(hào)、來自長興的16號(hào)以及來自安吉大溪的39號(hào)，這可能是由于不同地理?xiàng)l件的環(huán)境因素或者是由于種群內(nèi)的基因突變所引起的，這些突變經(jīng)自然選擇一些中性突變通過隨機(jī)過程整合到基因組中，即可形成豐富的分子水平豐富的遺傳多樣性。

3.2 金錢松種質(zhì)資源的保護(hù)策略

造成金錢松瀕危的原因主要有：一是殘存的個(gè)體稀少，分布零星，加上人為破壞，使其生存環(huán)境受到嚴(yán)重威脅，資源日漸減少；二是金錢松結(jié)實(shí)有大小年之分，一般3～5 a豐產(chǎn)1次，對(duì)其大量繁殖有明顯地影響。

本研究中，金錢松的遺傳多樣性非常豐富，能為植物遺傳改良提供理論指導(dǎo)。通過對(duì)金錢松種子園的遺傳結(jié)構(gòu)分析可以獲得群體遺傳多樣性、遺傳變異分布式樣等方面的重要數(shù)據(jù)，對(duì)實(shí)現(xiàn)物種的有效管理和制定合理的保護(hù)策略有重要參考價(jià)值［29－30］。因此，結(jié)合金錢松的群體遺傳多樣性，對(duì)現(xiàn)存的金錢松種質(zhì)資源采取就地保存策略時(shí)，重視大范圍群體內(nèi)不同類型個(gè)體的保存，盡可能防止人為破壞帶來的遺傳資源的流失。另一方面，由于浙江省內(nèi)金錢松的遺傳多樣性較豐富，因此，在對(duì)金錢松種質(zhì)資源實(shí)施保存時(shí)，不能僅考慮到群體內(nèi)不同個(gè)體的保存，同時(shí)也應(yīng)對(duì)不同地理區(qū)域的群體進(jìn)行保存，可以進(jìn)行遷地保護(hù)［32］，盡可能多地收集其他地區(qū)的金錢松種質(zhì)材料，建立種質(zhì)資源庫。本研究即是通過對(duì)建立浙江省安吉縣靈峰寺林場(chǎng)的金錢松的種子園，可以為此加大種群間的交換，為基因交流和重組創(chuàng)造條件，以保存孑遺金錢松的遺傳多樣性和金錢松的種質(zhì)資源。

圖2 金錢松種質(zhì)資源聚類圖Figure 2 Dendrogram of Pseudolarix amabilis germ plasm resource

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