黃虎膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

馮建安 ，謝守德，李 希，易曉霞 ，唐曉瑩

(1.四川省中醫(yī)藥科學(xué)院中醫(yī)研究所，四川 成都 610031; 2.成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，四川 成都 610075)

黃虎膠囊由虎杖、黃連、山豆根、龍膽草、甘草等組方，具有清利濕熱、解毒止痛、散瘀保肝的功效，主治病毒性乙型肝炎中肝膽濕熱夾瘀型。筆者對(duì)該制劑進(jìn)行了質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

Agilent1100型高效液相色譜儀，VWD紫外檢測器(美國Agilent公司);超聲波提取器(中船七院七二六所);BP211D型十萬分子一電子天平(德國Sartorius公司);艾科蒲實(shí)驗(yàn)室分析型純化水機(jī)(頤洋企業(yè)發(fā)展有限公司);玻璃點(diǎn)樣毛細(xì)管(華西醫(yī)科大學(xué)儀器制造廠);層析缸100 mm×200 mm(上海信宜儀器廠);939薄層自動(dòng)鋪板器(重慶貝可得公司)。硅膠G(青島海洋化工集團(tuán));大黃素對(duì)照品(含量測定用，批號(hào)為110756－200110)、大黃素甲醚對(duì)照品(含量測定用，批號(hào)為110758－200408)、氧化苦參堿對(duì)照品(含量測定用，批號(hào)為110780－200506)、苦參堿對(duì)照品(含量測定用，批號(hào)為 110805－200507)、鹽酸小檗堿(含量測定用，批號(hào)為110713－200208)、龍膽苦苷對(duì)照品(批號(hào)為 110770－200510)、虎杖對(duì)照藥材(批號(hào)為120980－200002)、山豆根對(duì)照藥材(批號(hào)為120913－200407)，黃連對(duì)照藥材(批號(hào)為120913－200407)均由中國藥品生物制品檢定所提供。試劑均為分析純或色譜純，超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層色譜鑒別

虎杖:取膠囊內(nèi)容物2 g，加甲醇50 mL，超聲處理15 min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)?.5 moL/L硫酸溶液10 mL，水浴加熱30 min，放冷，用三氯甲烷振搖提取2次，每次10 mL，全并三氯甲烷液，蒸干，殘?jiān)尤燃淄? mL使溶解，作為供試品溶液。同法制備陰性對(duì)照品溶液。另取虎杖對(duì)照藥材0.5 g，同法制成對(duì)照藥材溶液。再取大黃素對(duì)照品、大黃素甲醚對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL各含1 mg的混合溶液，作為對(duì)照品溶液。吸取上述5種溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以石油醚(30～60℃)－甲酸乙酯－甲酸(15∶5∶1)的上層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，置氨蒸氣中熏后，日光下檢視。供試品溶液色譜中，在與對(duì)照藥材溶液色譜和對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的紅色斑點(diǎn)，陰性對(duì)照品溶液無干擾(圖1)。

山豆根:取膠囊內(nèi)容物2 g，加三氯甲烷30 mL，濃氨試液1 mL，振搖30 min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)尤燃淄?.5 mL使溶解，作為供試品溶液。同法制備陰性對(duì)照品溶液。另取山豆根對(duì)照藥材0.5 g，加三氯甲烷 10 mL，濃氨試液 0.2 mL，振搖 15 min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)尤燃淄?.5 mL使溶解，作為對(duì)照藥材溶液。再取氧化苦參堿對(duì)照品、苦參堿對(duì)照品，分別加三氯甲烷制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法[2010年版《中國藥典(一部)》附錄ⅥB]試驗(yàn)，吸取供試品溶液和陰性對(duì)照品溶液各10 μL、對(duì)照藥材溶液和對(duì)照品溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以三氯甲烷－甲醇－濃氨試液(4∶1∶0.1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以稀碘化鉍鉀試液。供試品溶液色譜中，在與對(duì)照藥材和對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，陰性對(duì)照品溶液無干擾(圖2)。

圖1 虎杖薄層色譜圖

圖2 山豆根薄層色譜圖

黃連:取膠囊內(nèi)容物2 g，加甲醇50 mL，超聲處理15 min，濾過，濾液濃縮至干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。同法制備陰性對(duì)照品溶液。另取黃連對(duì)照藥材50 mg，同法制成對(duì)照藥材溶液。再取鹽酸小檗堿對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法[2010年版《中國藥典(一部)》附錄ⅥB]試驗(yàn)，吸取供試品溶液和陰性對(duì)照品溶液各10 μL、對(duì)照藥材溶液和對(duì)照品溶液各1 μL分別點(diǎn)于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以甲苯－醋酸乙酯－異丙醇－甲醇－ 水(6∶3 ∶1.5∶1.5∶0.3)為展開劑，置氨蒸氣預(yù)平衡 20 min的展開缸內(nèi)，展開，取出，晾干，置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品溶液色譜中，在與對(duì)照藥材溶液色譜和對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，陰性對(duì)照品溶液無干擾(圖3)。

龍膽草[1]:取膠囊內(nèi)容物2 g，加甲醇50 mL，超聲處理15 min，濾過，濾液濃縮至干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。同法制備陰性對(duì)照品溶液。另取龍膽苦苷對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法[2010年版《中國藥典(一部)》附錄ⅥB]試驗(yàn)，吸取上述3種溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠GF254薄層板上，以乙酸乙酯－甲醇－水(20∶2∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈(254 nm)下檢視。供試品溶液色譜中，在與對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對(duì)照品溶液無干擾(圖4)。

圖3 黃連薄層色譜圖

圖4 龍膽草薄層色譜圖

2.2 含量測定

2.2.1 色譜條件[2－4]

色譜柱:Agilent Eclipse XDB－C18柱(150 mm ×4.6 mm，5 μm);保護(hù)柱:Agilent Zorbax xdb－C18柱(4 mm ×4 mm，5 μm);流動(dòng)相:甲醇－0.1% 磷酸(80 ∶20);流速:1.0 mL/min;柱溫:30 ℃;檢測波長:254 nm。

2.2.2 溶液制備

精密稱取以五氧化二磷為干燥劑減壓干燥24 h的大黃素對(duì)照品10.92 mg，置50 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻即得質(zhì)量濃度為0.2184 g/L的對(duì)照品溶液。取膠囊內(nèi)容物約0.5 g，精密稱定，精密加入三氯甲烷50 mL和2.5 moL/L硫酸溶液20 mL，稱定質(zhì)量，置80℃水浴中分別加熱回流2 h，冷卻至室溫。再稱定質(zhì)量，加三氯甲烷補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻。分取三氯甲烷液，精密量取4 mL，蒸干，殘?jiān)蛹状际谷芙?，轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，微孔濾膜(0.45 μm)濾過，作為供試品溶液。取陰性樣品0.5 g，按供試品溶液的制備項(xiàng)下方法同法制成陰性對(duì)照品溶液。

2.2.3 方法學(xué)考察

系統(tǒng)適用性試驗(yàn):分別精密吸取2.2.2項(xiàng)下3種溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀測定。結(jié)果大黃素保留時(shí)間為4.7 min，陰性對(duì)照品溶液無干擾(見圖5)。

圖5 高效液相色譜圖

線性關(guān)系考察:分別精密量取對(duì)照品溶液1，2，3，4，5 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，精密吸取10 μL注入高效液相色譜儀測定。以峰面積 A對(duì)質(zhì)量濃度 C(μg/mL)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程 A=4076.08 X－125.5481(r=0.9999)。結(jié)果表明，大黃素質(zhì)量濃度在21.84～109.20μg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。

精密度試驗(yàn):精密量取對(duì)照品溶液2 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，連續(xù)進(jìn)樣10 μL，測定6次，記錄色譜圖，結(jié)果大黃素平均峰面積為2123.644，RSD為0.54%(n=6)，表明儀器精密度良好。

重現(xiàn)性試驗(yàn):取同一批膠囊(批號(hào)為080301)內(nèi)容物0.5 g，共6份，精密稱定，按供試品溶液制備方法制備，進(jìn)樣10 μL，測定大黃素峰面積。結(jié)果的 RSD為2.44%(n=6)，表明方法重現(xiàn)性良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn):精密吸取同一供試品溶液10 μL，分別于0，2，4，8，24 h時(shí)進(jìn)樣。結(jié)果峰面積的 RSD為 0.74%(n=5)，表明供試品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

加樣回收試驗(yàn):取已知含量的樣品(批號(hào)為080301)9份，分別加入大黃素對(duì)照品溶液(0.2184 g/L)適量，按成品供試品溶液的制備方法及色譜條件進(jìn)行測定，結(jié)果見表1。

表1 大黃素加樣回收試驗(yàn)結(jié)果(n=9)

2.3 樣品含量測定

取3個(gè)批號(hào)的樣品各2份，依法制備供試品溶液，分別精密吸取對(duì)照品溶液和供試品溶液各10 μL進(jìn)樣，測定峰面積，計(jì)算大黃素的含量。結(jié)果批號(hào)為080801、080802、080803的樣品中，大黃素平均含分量別為 5.93，5.87，6.16 mg/粒(n=2)。

3 討論

虎杖、黃連、山豆根、龍膽草的薄層色譜鑒別試驗(yàn)中曾分別用正己烷－乙酸乙脂－甲酸(30∶10∶0.5)[5]、正丁醇－冰醋酸－水(7∶1∶2)、甲苯－丙酮－甲醇－濃氨試液(5∶5∶3∶0.2)、三氯甲烷－乙醇－水(10∶3∶1)下層溶液[1]為展開劑展開，結(jié)果也能對(duì)虎杖、黃連、山豆根、龍膽草進(jìn)行鑒別，但正文中展開劑效果更好，因此選用正文中展開劑對(duì)黃虎膠囊進(jìn)行質(zhì)量控制。

含量測定中供試品溶液的制備對(duì)水解時(shí)間進(jìn)行了考察，最終確定了水解時(shí)間2 h。此外還使用不同品牌色譜柱進(jìn)行了測定方法的耐用性試驗(yàn)，結(jié)果含量測定結(jié)果相近，表明所建立的含量測定方法具有較好的耐用性。

[1]劉訓(xùn)紅，王玉璽，房克慧，等.中藥材薄層色譜鑒別[M].天津:天津科學(xué)技術(shù)出版社，1990:162.

[2]莫可豐，覃潔萍.HPLC法測定清火片中大黃素和大黃酚的含量[J].中國中醫(yī)藥信息雜志，2004，11(1):51.

[3]唐小波，吳健兒，趙緒元.高效液相色譜法測定虎杖中大黃素的含量[J].基層中藥雜志，2000，14(4):17.

[4]劉光喜.復(fù)方虎杖驅(qū)毒膠囊中大黃素的含量測定研究[J].湖南中醫(yī)雜志，2003，19(3):57.

[5]國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典中藥薄層彩色圖譜集[M].廣州:廣東科學(xué)技術(shù)出版社，1993:22.