芪藶強(qiáng)心膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究＊

李向軍，許紅輝，張永鋒，柏艷柳，李曉燕

(河北以嶺醫(yī)藥研究院，河北 石家莊 050035)

芪藶強(qiáng)心膠囊由黃芪、人參、桂枝、香加皮、陳皮等藥味組方，為本單位自行研發(fā)的中藥六類新藥。為有效控制成品質(zhì)量，筆者對方中的人參、丹參、香加皮、桂皮醛、橙皮苷進(jìn)行了鑒別，并測定了制劑中黃芪甲苷的含量?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

Agilent 1100 Series高效液相色譜儀;2000ES型蒸發(fā)光檢測器(奧泰);Waters 2695 Separations Module、Waters 2424 ELS Detector、Milli－Q Advantage A10超純水系統(tǒng)。芪藶強(qiáng)心膠囊(石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司，批號為100107);黃芪甲苷對照品(批號為110781－200613)、人參皂苷 Rb1對照品(批號為 110704－200921)、人參皂苷Rb2對照品(批號為111715－200802)、人參皂苷 Rf對照品(批號為111719－200703)、丹參對照藥材(批號為120923－200610)、香加皮對照藥材(批號為 121025－200503)、桂皮醛對照品(批號為110710－200714)、橙皮苷對照品(批號為110721－200613)均購自中國藥品生物制品檢定所。乙腈(Fisher，色譜純);水為自制超純水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 鑒別

人參:取人參皂苷Rb1對照品、人參皂苷Rb2對照品和人參皂苷Rf對照品，加甲醇制成每1 mL含0.2 mg各成分的溶液，作為對照品溶液。吸取對照品溶液和含量測定項(xiàng)下的供試品溶液各5～15 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。供試品溶液色譜中，應(yīng)出現(xiàn)與對照品色譜峰保留時間相同的色譜峰，見圖1。

圖1 人參高效液相色譜圖

丹參:取本品內(nèi)容物2 g，加甲醇25 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干;殘渣加水25 mL使溶解，濾過，濾液用鹽酸調(diào)pH至1～2，用乙酸乙酯提取2次，每次15 mL，合并提取液，蒸干，殘渣加無水乙醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。取缺丹參陰性樣品，同法制備陰性對照品溶液。另取丹參對照藥材1 g，加水30 mL回流30 min，放冷后濾過，濾液用鹽酸調(diào)pH至1～2，用乙酸乙酯提取2次，每次15 mL，合并提取液，蒸干，殘渣加無水乙醇2 mL使溶解，作為對照藥材溶液。吸取上述溶液各3～7 μL，分別點(diǎn)于同一以0.4%的羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以甲苯－二氯甲烷－乙酸乙酯－甲酸(5∶5∶5∶0.8)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以2%三氯化鐵溶液，熱風(fēng)吹至斑點(diǎn)顯色清晰，日光下檢視。供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液色譜相應(yīng)位置上至少顯1個相同顏色的主斑點(diǎn)，陰性對照品溶液色譜則無此斑點(diǎn)(圖2 A)。

香加皮:取含量測定項(xiàng)下“剩余甲醇溶液蒸至約2 mL”的溶液，作為供試品溶液。取缺香加皮陰性樣品，同法制備陰性對照品溶液。另取香加皮對照藥材0.5 g，同法制成對照藥材溶液。吸取供試品溶液和陰性對照品溶液各5～10 μL，對照藥材溶液2～4 μL，分別點(diǎn)于同一以0.4%羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以石油醚(60～90℃)－乙酸乙酯－冰醋酸(20∶3∶0.5)為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈下于254 nm波長處檢視。供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液色譜相應(yīng)位置上現(xiàn)顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，陰性對照品溶液色譜則無此斑點(diǎn)(圖2 B)。

桂皮醛:取本品內(nèi)容物2 g，置具塞錐形瓶中，加乙醇20 mL，密塞，浸泡20 min，振搖10 min，濾過，濾液作為供試品溶液。取缺桂枝陰性樣品，同法制備陰性對照品溶液。另取桂皮醛對照品，加乙醇制成每1 mL含1 μL的對照品溶液。照薄層色譜法[2010年版《中國藥典(一部)》附錄ⅥB]試驗(yàn)，吸取供試品溶液和陰性對照品溶液各 10 ～ 15 μL，對照品溶液 2 μL，分別點(diǎn)于同一以 0.4% 羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以石油醚(60～90℃)－乙酸乙酯(17∶3)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以二硝基苯肼乙醇試液。供試品溶液色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對照品溶液色譜則無此斑點(diǎn)(圖2 C)。

橙皮苷:取香加皮鑒別項(xiàng)下供試品溶液蒸干，加水10 mL使溶解，用三氯甲烷萃取2次，每次15 mL，棄去三氯甲烷層;水層繼續(xù)用乙酸乙酯15 mL萃取1次，將乙酸乙酯層蒸干，加甲醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。取缺陳皮陰性樣品，同法制備陰性對照品溶液。另取橙皮苷對照品，加甲醇制成飽和的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法[2010年版《中國藥典(一部)》附錄ⅥB]試驗(yàn)，吸取供試品溶液和陰性對照品溶液各5～10 μL，對照品溶液2 μL，分別點(diǎn)于同一以0.4%羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以三氯甲烷－乙酸乙酯－甲醇－水(15∶40∶22∶10)，10℃以下放置的下層溶液為展開劑，4℃以下展開，取出，晾干，噴以三氯化鐵試液，置紫外光燈下于365 nm波長處檢視。供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，陰性對照品溶液色譜則無此斑點(diǎn)(圖2 D)。

圖2 薄層色譜鑒別圖

2.2 黃芪甲苷含量測定

2.2.1 色譜條件

色譜柱:菲羅門 Gemini C18柱(150 mm × 4.6 mm，5 μm)，用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑;流動相:乙腈－水(30∶70);流速:1 mL/min;蒸發(fā)光檢測器;柱溫:30℃。理論板數(shù)按黃芪甲苷計算應(yīng)不低于4000。

2.2.2 溶液制備

精密稱取黃芪甲苷對照品適量，置量瓶中，加70%甲醇制成每1 mL含80μg的溶液，即得黃芪甲苷對照品溶液。取樣品裝量差異項(xiàng)下內(nèi)容物，研細(xì)，取2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加甲醇50 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min(功率250 W，頻率40 kHz)，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液20 mL，蒸干;剩余甲醇溶液蒸至約2 mL，作為香加皮鑒別供試品溶液;殘渣加3%氫氧化鈉溶液20 mL使溶解，用水飽和正丁醇萃取3次，每次20 mL，合并正丁醇液，用正丁醇飽和的水洗滌2次，每次25 mL，合并水洗液，水洗液用水飽和正丁醇20 mL萃取1次，合并正丁醇液，蒸干，殘渣用70%甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至5 mL容量瓶中，加70%甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，即得供試品溶液。

2.2.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn)考察:稱取約1/10處方量的方中藥材，除去黃芪，按制備工藝制得空白樣品，按供試品溶液的處理方法進(jìn)行處理，得陰性對照品溶液。吸取陰性對照品溶液、對照品溶液和供試品溶液，按照選定的測定條件進(jìn)行檢測。結(jié)果陰性無干擾，見圖3。

線性關(guān)系考察:取質(zhì)量濃度為79.92μg/mL的對照品溶液，分別精密吸取 10，25 ，40，60，70，80，90 μL，注入液相色譜儀，測定峰面積，以峰面積積分值(lny)為縱坐標(biāo)、進(jìn)樣量(lnx)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果黃芪甲苷進(jìn)樣量在799.2～7192.8 ng范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好線性關(guān)系，回歸方程為lny=1.8627 lnx－7.0613，r=0.9999(n=7)。

圖3 含量測定高效液相色譜圖

精密度試驗(yàn):分別精密吸取對照品溶液及同一份供試品溶液，按擬訂色譜條件連續(xù)各進(jìn)樣5次。結(jié)果黃芪甲苷對照品的峰面積RSD為0.23%，樣品中黃芪甲苷的峰面積 RSD為0.24%，表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn):分別精密吸取對照品溶液及供試品溶液，在0，3，6，9，12，24 h時測定色譜峰吸收值。結(jié)果在24 h內(nèi)黃芪甲苷對照品和樣品穩(wěn)定，RSD分別為0.98%和0.85%。

重復(fù)性試驗(yàn):取同批樣品 9 份，分別取 1.6，2.0，2.4 g，每個取樣量各制備3份供試品溶液并依法檢測。結(jié)果樣品中黃芪甲苷的平均含量為 1.7119 mg/g，RSD 為 3.18%。

加樣回收試驗(yàn):取同一批樣品9份，分為3組，分別加入高、中、低質(zhì)量濃度的對照品溶液50 mL，進(jìn)行超聲提取，測定，計算回收率。結(jié)果見表1。

表1 黃芪甲苷加樣回收試驗(yàn)測定結(jié)果(n=9)

3 討論

黃芪供試品溶液制備簡便，含量測定時剩余的甲醇可用于香加皮、橙皮苷的鑒別，不但縮短了樣品制備時間，還大量節(jié)省了試劑，降低了污染，更利于環(huán)境保護(hù)。

本方法中人參鑒別采用高效液相色譜－蒸發(fā)光散射檢測法，在進(jìn)行黃芪甲苷含量測定的同時進(jìn)行人參鑒別，質(zhì)檢工作量大大降低，提高了工作效率。