槲皮素長循環(huán)納米脂質體的小鼠口服吸收研究*

王剛，常明泉，楊光義，曾南，葉方

(1.湖北醫(yī)藥學院附屬太和醫(yī)院藥學部，湖北十堰 442000;2.成都中醫(yī)藥大學藥學院，610075)

槲皮素(quercetin，QUE)為一種天然的黃酮類化合物，槐米、款冬花、高良姜、側柏葉、桑寄生等許多中藥均含有該成分。槲皮素能通過多種途徑誘導腫瘤細胞凋亡，是目前最強的抗腫瘤藥物之一［1］。國外I和II期臨床試驗證實，槲皮素在體內能抑制多種腫瘤進展，并且在美國和歐洲一些國家已經上市。然而，由于槲皮素不溶于水，導致吸收受限，生物利用度低，難以在腦組織中達到有效的治療濃度［2］，限制槲皮素抗腦膠質瘤應用。筆者在本實驗采用乳化蒸發(fā)-低溫固化法制備槲皮素長循環(huán)納米脂質體(long circulating nano-liposomes of quercetin，QUE-LCL)，以正交實驗法優(yōu)化的制備工藝制備QUE-LCL，并對其理化性質及小鼠口服吸收特性進行研究，報道如下。

1 材料

1.1 試藥 山崳酸甘油酯(武漢祥和精細化工有限公司，批號:100305)，大豆卵磷脂(武漢祥和精細化工有限公司，批號:100310)，膽固醇(武漢祥和精細化工有限公司，批號:100305)，聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(PEG2000-DSPE，武漢祥和精細化工有限公司，批號:100305)、聚山梨酯-80(上海化學試劑廠，批號:20081006)，泊洛沙姆188(武漢祥和精細化工有限公司，批號:100310)，槲皮素(自制，批號:20100714，純度:89.8%)，槲皮素對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號:100081-200406)，甲醇為色譜純，水為純化水，其他試劑均為分析純。

1.2 儀器 戴安3000型高效液相色譜儀，DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(鞏義市英峪予華儀器廠)，Zetasizer3000粒徑測定儀(英國Malvem公司)，TGL-16G臺式高速離心機(上海安亭科學儀器廠)，JEM-2010透射電子顯微鏡(日本電子公司)，電子天平(熊貓集團南京電子計量有限公司)。

1.3 動物 昆明種小鼠，體質量(20±3)g，湖北醫(yī)藥學院實驗動物中心提供，實驗動物生產許可證:SCXK(鄂)2005-0008;實驗動物使用許可證:SYXK(鄂)2005-0031。

2 方法與結果

2.1 QUE-LCL 的制備

2.1.1 水相溶液的制備 稱取一定比例的泊洛沙姆和聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(1∶1)，加入適量聚山梨酯-80構成水相，水浴加熱至(75±5)℃。

2.1.2 油相溶液的制備 精確稱取適量山崳酸甘油酯和膽固醇，80℃水浴熔融;精確稱取適量槲皮素和大豆卵磷脂，共溶于適量丙酮∶三氯甲烷(1∶1)溶劑中，混合后成油相。

2.1.3 QUE-LCL制備 采用乳化蒸發(fā)-低溫固化法制備，以正交實驗法優(yōu)化的處方與制備工藝制備QUELCL，其中大豆卵磷脂∶膽固醇∶PEG 2000-DSPE=(2∶1∶1)，藥脂質量比=1∶10。將水相置于75℃水浴中，以600～800 r·min-1轉速攪拌0.5 h，采用6 號針頭將油相注入水相中(注射速度2mL·min-1)，進行包封，攪拌2 h。然后將攪拌的脂質體置于－2℃冰水浴中進行低溫固化，加冰水約10mL，攪拌1 h，制得納米脂質體混懸液［3］。

2.2 QUE-LCL包封率的測定

2.2.1 測定波長的選擇 分別加入甲醇溶解并稀釋空白納米脂質體和含藥納米脂質體，制成澄清溶液，在200～400 nm波長紫外掃描，槲皮素在254 nm波長處有顯著的吸收峰，而空白納米脂質體無吸收峰。因此選擇測定波長為254 nm。高效液相色譜(HPLC)圖譜表明，槲皮素對照品和槲皮素納米脂質體在254 nm處均有顯著的吸收峰，保留時間約為10.31 min。

2.2.2 色譜條件 色譜柱:Diamonsil-C18柱(250mm×4.6mm，5 μm);流動相:甲醇-4.3% 乙酸溶液(55∶45);流速為1.0mL·min-1;檢測波長為254 nm;柱溫30 ℃［4］;進樣量 20 μL。

2.2.3 對照品溶液的制備 精密稱取在105℃減壓干燥至恒質量的槲皮素對照品2.0 mg，加甲醇超聲溶解，定容至10mL的溶液，即得。

2.2.4 標準曲線的繪制 分別吸取槲皮素對照品溶液 0.1，2.0，4.0，6.0，8.0，10.0mL 至 10mL 棕色量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，即得 2.0，40，80，120，160，200 μg·mL-1的對照品溶液，精密吸取 20 μL 進樣，按“2.2.2”項下色譜條件測定，重復操作3次，以峰面積(A)為縱坐標，濃度(C)為橫坐標進行線性回歸，標準曲線方程為:A=1.343 5C－1.490 4(r=0.999 6)，結果表明:槲皮素在 2.0 ～200.0 μg·mL-1范圍內呈良好的線性關系。

2.2.5 供試品溶液的制備 用高速離心法分離脂質體與游離藥物。精密吸取槲皮素納米脂質體混懸液1.0mL，置于塑料小管中，16 000 r·min-1高速離心15 min，取上清液進樣測定，即得游離藥物(W游)。精密量取槲皮素脂質體溶液1.0mL，置10mL棕色量瓶中，加入10%Triton X-100乙醇溶液0.5mL破乳，甲醇溶液定容至刻度，搖勻。HPLC法測定1.0mL脂質體混懸液中總藥物量(W總)(空白脂質體混懸液在同樣條件下處理，在藥物峰位處無干擾)。HPLC法測定藥物濃度，計算包封率。包封率計算方法如下:包封率=(1－W游/W總)×100%。按優(yōu)化處方制備 QUELCL混懸液3批，測定其包封率，3次測定結果分別為91.37%，92.45%，91.49%，平均包封率為91.77%。

2.3 QUE-LCL粒徑、形態(tài)的檢測 以5%葡萄糖溶液稀釋納米脂質體混懸液，取上述稀釋樣品適量，經2%磷鎢酸染色于透射電鏡下觀察粒子形態(tài)為球狀或類球狀粒子(圖1)。在測量小杯中置激光粒度分析儀檢測其粒徑分布，結果制備的槲皮素納米脂質體的平均粒徑為172.6 nm，粒徑范圍為100～300 nm。

圖1 槲皮素納米脂質體的透射電鏡照片(×1 000)Fig.1 Transmission electron image ofquercetin nanoliposomes(×1 000)

2.4 小鼠灌胃槲皮素納米脂質體吸收實驗 昆明種小鼠60只，體質量為(20±2)g，隨機分為3組，槲皮素原料藥組、QUE-LCL混懸液組、普通脂質體組，每組20只。將以上小鼠給藥前禁食12 h，自由飲水。分別灌胃給予槲皮素原料藥(槲皮素混懸于4%羧甲基纖維素鈉)和槲皮素納米脂質體混懸液，給藥劑量均為50 mg·kg-1，給藥后于 l，3，6，9，12 h 處死小鼠，每次處死4只，立即取出自食管下端至肛門的內容物，并用無水乙醇清洗胃腸道管壁，同時收集實驗開始到取樣時間的所有糞樣，合并。

2.4.1 樣品處理 取胃腸道內容物和糞樣的混合物，加入無水乙醇約80mL，超聲提取約1 h后，過濾，用無水乙醇洗滌殘渣并定容至100mL。

2.4.2 測定波長的確定 按“2.4.1”項處理空白胃腸道內容物與糞樣混合物，及含有QUE或含有QUELCL的胃腸道內容物及糞樣混合物后，于200～500 nm波長范圍內進行紫外掃描，含 QUE與 QUELCL的樣品處理后在254 nm波長處有最大吸收，空白胃腸道內容物及糞樣的混合物在此波長處無干擾，而空白納米脂質體經乙醇處理后在254 nm處也無干擾，故在此波長處測定小鼠口服給藥一定時間后在胃腸道中以及排出體外的藥物。

2.4.3 色譜條件 色譜柱:Diamonsil-C18柱(250mm×4.6mm，5 μm);流動相:甲醇-4.3% 乙酸溶液(55∶45);流速為1.0mL·min-1;檢測波長為254 nm;柱溫30 ℃［4］;進樣量 20 μL。

2.4.4 線性關系考察 精密稱取槲皮素對照品50 mg，置于50mL量瓶中，加無水乙醇溶解并稀釋至刻度。分別精密吸取 0.2，2.0，4.0，8.0，10.0，20.0mL，加入空白胃腸道內容物和糞樣的混合物中，樣品處理方法按“2.4.1”處理，分別配置成 2.0，20.0，40.0，80.0，100.0，200.0 μg·mL-1標準應用液，精密吸取20 μL進樣，以峰面積為縱坐標，濃度為橫坐標進行線性回歸，標準曲線方程為:A=0.090 8C+0.157(r=0.999 2)，結 果 表明:槲 皮 素 在 2.0 ～200.0 μg·mL-1范圍內呈良好的線性關系。

2.4.5 重復性實驗 取槲皮素對照品按照“2.4.1”項下方法平行制備6份樣品溶液，測定并計算含量，相對標準偏差(RSD)為1.86%。

2.4.6 精密度實驗 槲皮素對照品按照“2.4.1”項下方法制備樣品溶液，精密吸取20 μL連續(xù)進樣6次，按照上述色譜條件，測定，計算含量，RSD為1.65%。

2.4.7 穩(wěn)定性實驗 取槲皮素對照品溶液，按照“2.4.1”項下方法制備，于室溫(20～25℃)下放置，分別于0，2，4，6，8，10 h 精密吸取 20 μL 進樣，測定峰面積，并計算含量，RSD為1.84%。

2.4.8 回收率實驗 選擇在 2.0 ～200.0 μg·mL-1范圍內高、中、低3個濃度槲皮素對照品，添加槲皮素對照品溶液1.2，1.5，1.8mL，每個梯度平行 3 份;分別按“2.4.1”項下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件測定，計算得槲皮素的平均回收率分別為98.9%(RSD 為1.71%)，99.3%(RSD 為1.89%)和 97.4%(RSD 為1.91%)。

2.4.9 吸收百分率的測定 通過測定口服劑量(X1)及小鼠胃腸道及糞便中剩余的藥物量(X2)，利用公式:吸收百分率(%)=(X1－X2)/X1×100%，求得藥物吸收百分率。見表1。結果表明槲皮素原料藥吸收少，12 h的吸收不到60%;槲皮素普通脂質體吸收較少，12 h的吸收不到70%;而槲皮素制成長循環(huán)納米脂質體后，吸收百分率明顯提高，12 h的藥物吸收＞90%，吸收完全。

表1 槲皮素口服吸收百分率Tab.1 Oral absorption rate of quercetin %

3 討論

研究表明，槲皮素水溶性與脂溶性均較差［5］，本研究通過采用聚乙二醇-二硬脂?；字Ｒ掖及?PEG2000-DSPE)為修飾膜材，采用乳化蒸發(fā)-低溫固化法制備QUE-LCL，實驗結果表明以PEG2000-DSPE與聚山梨酯-80作為乳化劑可增加槲皮素納米脂質體的包封率，此外，本實驗采用山崳酸甘油酯、大豆卵磷脂和膽固醇作為油相于80℃水浴熔融槲皮素，能更好地使藥物熔融于油相中，與制備的槲皮素普通脂質體相比較，本實驗制備方法在增加槲皮素溶解度的同時提高包封率。

由于槲皮素在吸收過程中存在生物轉化［6］，多種轉化產物進入血液，在血液循環(huán)中藥物的清除極快，槲皮素在2 h后就已檢測不到，故不宜采用槲皮素血藥濃度法考察其制劑的吸收情況。研究表明，槲皮素主要經胃腸易化擴散吸收分布于胃腸道［7］。本實驗結果表明槲皮素制備成長循環(huán)納米脂質體后在胃腸組織分布濃度很高，制劑中的槲皮素長時間黏附于小腸壁(10～12 h)，且不易被排入大腸，而槲皮素原料藥在小鼠腸道中迅速通過小腸進入大腸(約6 h)，并隨大便排出。說明槲皮素制備成長循環(huán)納米脂質體有較好的胃腸黏附性，可有效延長藥物與胃腸黏膜的接觸時間，從而提高藥物在腸道中的吸收。

綜上所述，本實驗通過研究槲皮素及其在胃組織的藥物濃度和口服吸收百分率，為槲皮素的新制劑開發(fā)和應用墊定基礎。

［1］MURAKAMI A，ASHIDA H，TERAO J.Mutitargeted cancer prevention by quercetin ［J］.Cancer Lett，2008，269(2):315－325.

［2］UPPUGUNDLA N，ENGELBERTH A，VANDHANA RAVINDRANATH S，et al.Switchgrass water extracts:extraction，separation and biological activity of rutin and quercetin［J］.J Agric Food Chem，2009，57(17):7763－7770.

［3］XU F，YUAN Y，SHAN X，et al.Long-circulation of hemoglobin-loaded polymeric nanoparticles as oxygen carriers with modulated surface charges［J］.Int J Pharm，2009，377(1－2):199－206.

［4］YANG X，ZHANG X，YUAN Z，et al.Simultaneous determination of myricitrin，hyperin，quercitroside，and quercetin in folium rhododendrimicranthibyRP-HPLC［J］.J Chromatogr Sci，2009，47(8):714－717.

［5］LAN K，ZHANG Y，YANG J，et al.Simple quality assessment approach for herbal extracts using high performance liquid chromatography-UV based metabolomics platform［J］.J Chromatogr A，2010，1217(8):1414－1418.

［6］MORAND C，CRESPY V，MANACH C，et al.Plasma metabolites of quercetin and their antioxidant properties［J］.Am J Physiol，1998，275(1-2):212－219.

［7］孟德勝，汪士良.槲皮素及其苷類研究進展［J］.中國藥房，2000，11(5):232－233.