椎體成形術(shù)后椎體界面骨血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子mRNA表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究

趙 剛，胡偵明，舒 鈞，勞漢昌

（1.昆明醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院 急診科創(chuàng)傷骨科組，云南 昆明 650101；2.重慶醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 骨科，四川 重慶 400016；3.昆明醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院 骨科，云南 昆明 650101）

聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）因其良好的療效及安全性能受到廣泛使用，但PMMA植入體內(nèi)致骨組織損傷后修復(fù)過(guò)程至今仍未清楚，骨組織對(duì)PMMA植入后的反應(yīng)尚不清楚，國(guó)內(nèi)外均未見(jiàn)報(bào)到。本實(shí)驗(yàn)旨將PMMA骨水泥模仿椎體成形術(shù)植入老齡骨質(zhì)疏松兔腰椎椎體內(nèi)，觀察骨水泥－骨界面周?chē)墙M織的形態(tài)學(xué)改變及炎癥反應(yīng)情況，用適時(shí)定量PCR及蛋白印記技術(shù)（Western blot）檢測(cè)骨水泥－骨界面周?chē)墙M織內(nèi)VEGF mRNA的擴(kuò)增及蛋白表達(dá)情況，擬從細(xì)胞及分子水平了解骨質(zhì)疏松性椎體壓縮骨折行椎體成形術(shù)后PMMA骨水泥周?chē)墙M織的損傷及修復(fù)情況，為全面評(píng)價(jià)PMMA骨水泥對(duì)機(jī)體的長(zhǎng)期影響及轉(zhuǎn)歸提供一定的理論及實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

材料及方法

一、實(shí)驗(yàn)器械及材料 腰椎前路器械、硬膜外穿刺針；骨密度儀(美國(guó)LUNAR公司)，PMMAⅢ型復(fù)合骨水泥(天津市合成工業(yè)材料研究所)；低溫高速離心機(jī)(Heraeus)，紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(Unico)，Real-time PCR儀(Bio-Rad)， 酶標(biāo)儀(Tecan).Western Blot試劑:小鼠抗兔VEGF單克隆抗體、山羊抗鼠HRP標(biāo)記IgG抗體、BCA-100蛋白質(zhì)定量試劑盒（上海申能博彩生物科技有限公司），其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純以上級(jí)別。

二、實(shí)驗(yàn)方法 1.動(dòng)物分組：老年新西蘭雌兔72只，體重3.1～4.2kg，平均3.7kg（由昆明醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供），經(jīng)DXA檢測(cè)符合骨質(zhì)疏松兔標(biāo)準(zhǔn)者采用。術(shù)前拍腰椎正側(cè)位X線片，顯示正常腰椎序列及骨質(zhì)結(jié)構(gòu)。72只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)編號(hào)，分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，再分為術(shù)后1h，24h，3d，7d，4w，12w亞組，每亞組各6只。實(shí)驗(yàn)組選擇L2、L4椎體節(jié)段植入PMMA骨水泥。各相應(yīng)對(duì)照組只進(jìn)行手術(shù)不植入PMMA，分別于術(shù)后1h，24h，3d，7d，4w，12w6個(gè)時(shí)相段處死動(dòng)物觀察。

2.動(dòng)物模型的制備和材料植入：手術(shù)步驟：⑴4%戊巴比妥那(1ml/kg)耳緣靜脈注射麻醉；⑵將兔子俯臥固定于操作臺(tái)上，定位L7(兩髖最高點(diǎn)連線交界處)，取背部正中切口，顯露L2～L6椎體的前半部分(后半部分外走行脊神經(jīng)，勿顯露，以防損傷)。由椎弓根中線與橫突前緣連線交點(diǎn)后方1mm處進(jìn)針，與水平面呈35°～40°夾角，與冠狀面呈0°～5°夾角，進(jìn)針深度4～6mm。將PMMA調(diào)配成可注射的稀糊狀(骨水泥粉∶液為4ml∶1g)裝入1ml注射器內(nèi)，通過(guò)硬膜外穿刺針緩慢注射，邊注射邊拔出穿刺針，注射量約0.5～0.6ml。以上操作每只進(jìn)行2個(gè)椎體，每組完成6只；⑶術(shù)后處理，術(shù)后7d肌肉注射青霉素100萬(wàn)U/只，1次/d。手術(shù)過(guò)程順利，實(shí)驗(yàn)組有1只術(shù)后因操作失誤將穿刺針刺入椎管引起癱瘓。術(shù)后所有兔子均由本院試驗(yàn)動(dòng)物中心專(zhuān)業(yè)人員飼養(yǎng)。術(shù)中、術(shù)后均無(wú)死亡。

3.X線檢查：在術(shù)后即刻和1h，24h，3d，7d，4w，12w處死動(dòng)物前，分別攝腰椎側(cè)位X線片檢查，觀察植入材料是否在椎體內(nèi)部，是否脫落和崩裂，觀察植入材料的形態(tài)。

4.標(biāo)本制作：⑴術(shù)后1h，24h，3d，7d，4w，12w取椎體檢測(cè)；⑵新鮮取出的椎體節(jié)段，去除椎體附件，包括附著的肌肉、韌帶、椎弓根、椎板和椎間盤(pán)，僅剩椎體，雙層塑料袋密閉后冷藏于-75℃保存?zhèn)溆?，測(cè)試前取出在室溫下自然解凍。

5.分子生物學(xué)操作：⑴配制試劑；⑵RT-PCR；⑶目的基因檢測(cè)；⑷Western Blot顯影定影。

研究中所用的引物如下。

6.實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析：⑴VEGF mRNA RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果計(jì)算 首先樣品Ct-內(nèi)參Ct=⊿Ct，以其中一個(gè)樣本⊿Ct（通常為對(duì)照組）為參照，計(jì)算⊿⊿Ct。計(jì)算方法為⊿Ct（樣本） -⊿Ct（參照）。最終樣本之間倍數(shù)關(guān)系為2的-⊿⊿Ct次冪

⑵蛋白表達(dá)結(jié)果 將X線膠片置于Tanon凝膠圖像處理系統(tǒng)，測(cè)定目的條帶的強(qiáng)度和面積，計(jì)算蛋白相對(duì)含量值，相對(duì)含量值＝強(qiáng)度×面積。

7.組織學(xué)觀察：在骨組織與材料交界處取材，僅留界面周?chē)墙M織，鋸成0.5cm×0.5cm×0.5cm大小，用10%中性福爾馬林液固定，EDTA脫鈣、脫水、透明石蠟包埋，8μm連續(xù)切片，HE染色后在光鏡下觀察炎癥反應(yīng)、骨壞死和新骨形成情況。

結(jié) 果

一、X線檢查 所有的填充材料未見(jiàn)脫落、崩裂、松動(dòng)。術(shù)后3個(gè)月植入材料與骨交界部位模糊不清，有新骨形成，但材料體積無(wú)明顯縮小。對(duì)照組，術(shù)后及3個(gè)月均見(jiàn)實(shí)驗(yàn)椎體有約有0.5大小直徑的圓形低密度區(qū)。

二、組織形態(tài)學(xué)觀察 植入PMMA組術(shù)后24h組界面骨組織見(jiàn)明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，未見(jiàn)明顯骨組織壞死表現(xiàn)，3d后炎癥反應(yīng)達(dá)高峰，至7d減輕，4w時(shí)未見(jiàn)明顯炎性細(xì)胞，12w無(wú)任何炎癥表現(xiàn)；4w時(shí)椎體骨與材料交界處出現(xiàn)軟骨細(xì)胞呈團(tuán)狀生長(zhǎng)并向編織骨分化，12w時(shí)細(xì)胞內(nèi)成骨明顯，可見(jiàn)大量的板層骨形成，偶爾可見(jiàn)到造血骨髓（見(jiàn)圖1～4）。

三、VEGF RT-PCR擴(kuò)增及蛋白表達(dá) 1.VEGF RT-PCR擴(kuò)增 以Actin作為內(nèi)參擴(kuò)增到分子量為157 bp目的條帶，根據(jù)內(nèi)參推斷，與文獻(xiàn)中擴(kuò)增到的基因片段一致，說(shuō)明此即為VEGF的目的條帶（見(jiàn)圖5）。

2.VEGF mRNA擴(kuò)增結(jié)果 PMMA術(shù)后1h及24hVEGF的表達(dá)減少且低于對(duì)照組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）；而術(shù)后3dVEGF的表達(dá)明顯增加，至7d時(shí)再次降低，低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；4～12wVEGF的表達(dá)持續(xù)增加，與實(shí)驗(yàn)7d組及相應(yīng)對(duì)照組比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）（見(jiàn)表1）。

3.VEGF蛋白檢測(cè)結(jié)果 PMMA術(shù)后1h及24hVEGF的表達(dá)略有升高，而術(shù)后3dVEGF的表達(dá)明顯增加，至7d時(shí)再次降低，而4～12wVEGF的表達(dá)明顯增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表2。

討 論

骨損傷后3d在間葉細(xì)胞和成骨細(xì)胞中可見(jiàn)TGF－β1，2，3，bFGF，F(xiàn)GFR，PDGF的表達(dá)[1]，5d VEGF的表達(dá)明顯增強(qiáng)，此時(shí)軟骨血管內(nèi)皮中這些物質(zhì)的表達(dá)達(dá)峰值，骨折7d后軟骨向骨轉(zhuǎn)化，骨折后14d出現(xiàn)軟骨內(nèi)骨化。Steinbrech等[2]的研究發(fā)現(xiàn)，在骨折愈合過(guò)程中VEGF的表達(dá)是上調(diào)的；機(jī)制為：骨折部位有缺氧；各種細(xì)胞在缺氧刺激下表達(dá)VEGF；缺氧能通過(guò)刺激成骨細(xì)胞產(chǎn)生VEGF，缺氧微環(huán)境能促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖、分化。但過(guò)度嚴(yán)重的缺氧也會(huì)減少細(xì)胞的增殖，細(xì)胞抗原分化減少，相應(yīng)的VEGF表達(dá)下調(diào)，從而認(rèn)為VEGF在骨折愈合及軟骨內(nèi)骨化中起到了關(guān)鍵作用。VEGF的表達(dá)，一定程度上可引起血管新生從而引導(dǎo)血流至骨折端，促進(jìn)骨折愈合。Komatsu[3,4]的研究表明，在骨折愈合的過(guò)程中均有VEGF的表達(dá)。骨折局部氧濃度的大小作為刺激原激活缺氧誘導(dǎo)因子（Hypoxia-inducible factor-1,HIF-1），刺激成骨細(xì)胞產(chǎn)生VEGF，在骨折的3～10d內(nèi)VEGF的表達(dá)即達(dá)到高峰，骨小梁內(nèi)可見(jiàn)VEGF的表達(dá)增高。Li[5]的研究表明，許多細(xì)胞因子最終是通過(guò)激活VEGF或使其表達(dá)上調(diào)而促進(jìn)骨折愈合。Hu[6]的研究表明，骨形態(tài)發(fā)生蛋白能增強(qiáng)VEGF及Ⅰ型膠原的活性而促進(jìn)骨折愈合，VEGF亦能增強(qiáng)BMP的作用，促進(jìn)骨礦化，但VEGF的含量過(guò)高會(huì)降低二者的協(xié)同作用。Chua[7]等離體加入TGF后2h即可見(jiàn)VEGF的表達(dá)增強(qiáng)，當(dāng)一定量離子輻射損害細(xì)胞分泌水平使TGF減少，破骨細(xì)胞增殖加速使VEGF的表達(dá)減少，骨折愈合延遲，表明TGF促進(jìn)骨骼生長(zhǎng)的作用是通過(guò)增強(qiáng)成骨細(xì)胞表達(dá)VEGF來(lái)實(shí)現(xiàn)的[8～10]。當(dāng)機(jī)體發(fā)生感染后，如膿毒血癥、骨髓炎等，能致VEGF mRNA表達(dá)降低，使VEGF合成減少，致感染時(shí)骨折延遲愈合甚至不愈合[11]。VEGF是在成骨細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生合成，然后以自分泌或旁分泌的方式分別參予骨礦化和血管新生作用[5]。該類(lèi)細(xì)胞所處的細(xì)胞外微環(huán)境對(duì)VEGF的產(chǎn)生有非常顯著的影響。微環(huán)境中的PH及乳酸濃度能對(duì)VEGF的表達(dá)產(chǎn)生獨(dú)立的影響。VEGF產(chǎn)生的最佳微環(huán)境為機(jī)體的中性環(huán)境（即pH=7.35～7.45，平均7.40） 最佳，當(dāng)pH值為7.0時(shí)，VEGF的表達(dá)明顯減少，而乳酸濃度增高時(shí)亦能抑制成骨細(xì)胞VEGF的表達(dá)[12]。國(guó)內(nèi)的研究表明[13]，VFGF表達(dá)量在傷后不同時(shí)相不盡相同，骨折后8h其表達(dá)己達(dá)到較高的水平，在24h有所降低，之后迅速回升，并在骨折后72h－3周維持在高表達(dá)狀態(tài)，5－8周表達(dá)連續(xù)降低。早期的研究表明[14,15]，PMMA對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞的毒性主要是引起成骨細(xì)胞壞死，是通過(guò)PMMA單體釋放羥自由基引起過(guò)氧化反應(yīng)造成細(xì)胞損傷。PMMA單體自由基可使骨－水泥界面處的巨噬細(xì)胞釋放花生四烯酸，并可使局部組織細(xì)胞產(chǎn)生釋放乳酸脫氫酶增多，產(chǎn)生類(lèi)似肉芽腫性炎癥反應(yīng)引起組織損傷。我們的研究結(jié)果顯示：PMMA術(shù)后1h及24h VEGF的表達(dá)減少且低于對(duì)照組，而術(shù)后3dVEGF的表達(dá)明顯增加，至7d時(shí)再次降低，而4～12w VEGF的表達(dá)明顯增加。24h組的降低可能與PMMA凝固時(shí)的放熱反應(yīng)及單體自由基的氧化反應(yīng)改變細(xì)胞的微環(huán)境抑制了成骨細(xì)胞活性，致VEGF的表達(dá)減少；至3d時(shí)由于炎癥反應(yīng)明顯增強(qiáng)，炎性細(xì)胞如巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等表達(dá)VEGF而出現(xiàn)VEGF高峰，7d隨著炎癥反應(yīng)的消退，炎性細(xì)胞減少，VEGF的表達(dá)減弱。隨著氧自由基的減少和熱反應(yīng)損傷的修復(fù)，細(xì)胞微環(huán)境恢復(fù)，成骨細(xì)胞活性正常，4w后可見(jiàn)VEGF的高表達(dá)，至12wVEGF表達(dá)降低，HE染色見(jiàn)骨組織修復(fù)完成，此時(shí)主要為破骨細(xì)胞釋放VEGF。從我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)：PVP術(shù)后PMMA骨水泥對(duì)周?chē)墙M織的損傷修復(fù)有一定影響，主要表現(xiàn)為時(shí)間延遲，但并未造成不可逆的缺血損傷。修復(fù)機(jī)制與正常骨折愈合是相似的，結(jié)果也無(wú)明顯區(qū)別，但時(shí)間比正常愈合進(jìn)程延遲4W左右。PVP術(shù)后骨水泥－骨界面周?chē)墙M織的細(xì)胞微環(huán)境改變有待進(jìn)一步研究。

表1 VEGF mRNA經(jīng) RT-PCR 擴(kuò)增⊿⊿Ct值 （s,n＝6）

表1 VEGF mRNA經(jīng) RT-PCR 擴(kuò)增⊿⊿Ct值 （s,n＝6）

注：*VS相應(yīng)對(duì)照，P＜0.05；＃VS對(duì)照 7d組，P＜0.05；▼VS實(shí)驗(yàn) 7d組，P＜0.001。

表2 VEGF蛋白表達(dá)檢測(cè)結(jié)果（s,n＝6）

表2 VEGF蛋白表達(dá)檢測(cè)結(jié)果（s,n＝6）

注：*VS相應(yīng)對(duì)照，P＜0.05。

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