依達(dá)拉奉聯(lián)合奧扎格雷對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷保護(hù)作用機(jī)制的研究

徐鳳鳴，劉志明

（曲靖市第一人民醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，云南 曲靖 655000）

缺血性腦血管病約占全部腦血管病的80%，其發(fā)病率、致殘率和病死率高，已成為嚴(yán)重危害人類健康的疾病之一[1]。如果在時(shí)間窗內(nèi)（6h） 血流迅速恢復(fù)，神經(jīng)細(xì)胞仍可存活并恢復(fù)功能，如超過時(shí)間窗，腦血流再通后可產(chǎn)生再灌注損傷，使腦損傷加劇，是腦缺血后腦功能障礙的主要因素。本實(shí)驗(yàn)觀察依達(dá)拉奉聯(lián)合奧扎格雷對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷后的保護(hù)作用，取得滿意結(jié)果，現(xiàn)總結(jié)如下。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：健康雄性青壯年SD大鼠50只，購(gòu)自昆明醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，體重280～350g，術(shù)前12h禁食，自由活動(dòng)。

藥品及試劑：依達(dá)拉奉注射液購(gòu)自南京先聲東元制藥有限公司，奧扎格雷注射液購(gòu)自武漢遠(yuǎn)成共創(chuàng)科技有限公司，IL-1，TNF-α購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。

二、動(dòng)物分組及給藥方法：將50只SD大鼠隨機(jī)分為5組，即假手術(shù)組、缺血/再灌注組、生理鹽水對(duì)照組、奧扎格雷組和依達(dá)拉奉聯(lián)合奧扎格雷組。奧扎格雷組在缺血前30min和再灌注后立即將奧扎格雷8mg·kg-1腹腔注射。依達(dá)拉奉聯(lián)合奧扎格雷組除注射相同劑量的奧扎格雷外，同時(shí)注射依達(dá)拉奉3mg·kg-1。對(duì)照組以相同時(shí)間相同劑量的生理鹽水腹腔注射。

三、缺血/再灌注組模型制備：根據(jù)Traystman[2]在腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ途C述中介紹的線栓法栓塞SD大鼠左側(cè)大腦中動(dòng)脈制備腦缺血模型。缺血2h后將尼龍線拉至頸總動(dòng)脈分叉處，即實(shí)現(xiàn)了再灌注，再灌注時(shí)間為12h。假手術(shù)組僅分離左側(cè)頸總動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈、不插入尼龍線。大鼠蘇醒后觀察右側(cè)肢體運(yùn)動(dòng)障礙（前爪不能伸展、爬行時(shí)向右側(cè)轉(zhuǎn)圈）即為模型制備成功。

四、神經(jīng)功能缺損評(píng)分：線栓法一般多采用改良Longa評(píng)分，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為，0分：無神經(jīng)功能缺損癥狀；1分：不能伸展對(duì)側(cè)前爪；2分：身體向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈；3分：身體向?qū)?cè)傾倒；4分：意識(shí)喪失，不能自發(fā)行走。

五、腦梗死面積的測(cè)定：缺血2h再灌注12h后，迅速將大鼠斷頭取腦，將前腦冠狀切成1.5mm厚的腦片，于0.5%TTC（氯化三苯基四氮唑）溶液中37℃水浴孵育染色15min后，取出用10%的甲醛溶液固定。染色后正常組織呈白色，梗死組織呈紅色。利用Photoshop圖像分析軟件觀測(cè)梗死范圍，通過測(cè)量梗死體積來衡量腦缺血的嚴(yán)重程度。

六、生化指標(biāo)的測(cè)定：將大鼠斷頭取腦，將大腦置于勻漿器中，制成腦組織勻漿。采用Lawry法蛋白定量，加入等容積的0.1mol/L稀醋酸混勻，4℃時(shí)4000r/min離心15min，取上清用放免法測(cè)定IL-1，TNF-α的含量（ng/ml），然后換算成（ng/mg）組織蛋白。

七、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：所有計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，應(yīng)用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS12.0兩組間樣本比較用t檢驗(yàn)，多組間數(shù)據(jù)的比較用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、5組大鼠神經(jīng)功能Longa評(píng)分的比較及依達(dá)拉奉聯(lián)合奧扎格雷對(duì)神經(jīng)功能的影響：除假手術(shù)組外，其它4組腦缺血/再灌注后，均出現(xiàn)了大鼠神經(jīng)功能缺陷，依達(dá)拉奉和奧扎格雷可降低大鼠神經(jīng)缺陷評(píng)分，與腦缺血/再灌注組及生理鹽水對(duì)照組比較差異有顯著性（P＜0.05），見附表。

二、5組大鼠腦梗死面積的比較及依達(dá)拉奉聯(lián)合奧扎格雷對(duì)腦梗死面積的影響：除假手術(shù)組外，其它4組腦缺血/再灌注后，均出現(xiàn)了大鼠腦組織梗死，依達(dá)拉奉和奧扎格雷可降低大鼠腦梗死面積，與腦缺血/再灌注組及生理鹽水對(duì)照組比較差異有顯著性（P＜0.05），見附表。

三、5組大鼠腦組織生化指標(biāo)的比較及依達(dá)拉奉聯(lián)合奧扎格雷對(duì)IL-1，TNF-α的影響：假手術(shù)組幾乎無IL-1，TNF-α因子的表達(dá)，腦缺血/再灌注組及生理鹽水對(duì)照組IL-1，TNF-α3h后開始升高，6.5h后達(dá)高峰后又逐漸下降；奧扎格雷組IL-1含量與腦缺血/再灌注組及生理鹽水對(duì)照組無顯著性差異（P＞0.05） ,TNF-α含量明顯下降，有顯著性差異（P＜0.05）；依達(dá)拉奉和奧扎格雷組IL-1，TNF-α含量均下降，與腦缺血/再灌注組及生理鹽水對(duì)照組比較均有顯著性差異（P＜0.05），見附表。

討 論

腦缺血再灌注的機(jī)制已經(jīng)有比較深入透徹的研究：在局部血管閉塞后，血流下降最嚴(yán)重的梗死中心區(qū)細(xì)胞迅速死亡，周圍的缺血半暗帶區(qū)的血流出現(xiàn)不同程度的下降，半暗帶區(qū)細(xì)胞死亡包括壞死和凋亡兩種機(jī)制。缺血級(jí)聯(lián)反應(yīng)：缺血→無氧代謝→pH下降→酸中毒→Na+-K+泵衰竭→細(xì)胞膜去極化→Mg+阻滯消除→興奮性毒性谷氨酸鹽釋放→NMDA、AMPA受體和代謝型受體激活→鈣內(nèi)流超載→細(xì)胞內(nèi)鈣調(diào)蛋白酶激活→NO產(chǎn)生過量→氧化應(yīng)激反應(yīng)，自由基形成→基因表達(dá)改變→壞死、凋亡。在缺血級(jí)聯(lián)反應(yīng)中每個(gè)環(huán)節(jié)都可以成為保護(hù)性治療的靶點(diǎn)。其中自由基損傷目前認(rèn)為是導(dǎo)致水腫形成和細(xì)胞凋亡的主要原因。自由基可激活炎性細(xì)胞因子和酶，導(dǎo)致小膠質(zhì)細(xì)胞激活 （Microglial activation） 產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，IL-1，TNF-α主要來源于小膠質(zhì)細(xì)胞，因此腦缺血再灌注后IL-1，TNF-α表達(dá)明顯增加，與腦組織的損傷程度呈正相關(guān)。IL-1是腦缺血再灌注損失的免疫炎癥反應(yīng)的基礎(chǔ)，是多種炎癥介質(zhì)失控釋放而形成的“瀑布效應(yīng)”的起始因子，可參與神經(jīng)損傷毒性，促進(jìn)自由基釋放，誘導(dǎo)發(fā)熱，降低腦血流[3]。TNF-α在缺血再灌注損傷中的作用機(jī)制主要誘導(dǎo)了細(xì)胞間粘附分子（ICAM-1） 表達(dá)，引起血管炎性反應(yīng)，使血液中TXA2活性增加而導(dǎo)致強(qiáng)烈的血管收縮和血小板聚集，促進(jìn)血栓形成和血管堵塞，加重腦缺血。對(duì)腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ皖A(yù)先給予IL-1，TNF-α抗體，可顯著降低腦缺血再灌注損傷，本實(shí)驗(yàn)中缺血再灌注組IL-1，TNF-α變化與上述相符，證明IL-1，TNF-α在缺血性腦損傷發(fā)生發(fā)展中起重要作用，提示通過各種方法拮抗IL-1，TNF-α有可能成為治療腦梗死的新途徑。奧扎格雷是高選擇性的TXA2合成酶抑制劑，抑制TXA2的產(chǎn)生及促進(jìn)前列環(huán)素的生成[4]，從而抑制TNF-α的表達(dá)，擴(kuò)張腦血管，增加大腦缺血區(qū)的血流量，使受損的腦組織功能恢復(fù)，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示奧扎格雷組IL-1含量與腦缺血/再灌注組及生理鹽水對(duì)照組無顯著性差異（P＞0.05），TNF-α含量明顯下降，有顯著性差異（P＜0.05）；證明奧扎格雷可能是通過抑制了TNF-α的表達(dá)來發(fā)揮腦保護(hù)作用的，對(duì)IL-1的表達(dá)無明顯影響。

依達(dá)拉奉是捕獲羥自由基的活性氧化劑，可抑制小膠質(zhì)細(xì)胞激活表達(dá)IL-1，TNF-α，對(duì)梗死周邊區(qū)域血流量減少有抑制作用，并通過抗氧化，減輕腦水腫，抑制遲發(fā)性神經(jīng)元死亡，保護(hù)腦組織[5]，還能防止血管內(nèi)皮細(xì)胞損失，發(fā)揮抗缺血作用[6]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示假手術(shù)組幾乎無IL-1，TNF-α因子的表達(dá)，腦缺血/再灌注組及生理鹽水對(duì)照組IL-1，TNF-α3h后開始升高，6.5h后達(dá)高峰后又逐漸下降；通過依達(dá)拉奉聯(lián)合奧扎格雷治療后腦組織中IL-1，TNF-α含量明顯減少，說明依達(dá)拉奉和奧扎格雷可以抑制IL-1，TNF-α激活和分泌，從而抑制炎性反應(yīng)，減輕再灌注損傷。

附表 各組神經(jīng)功能、腦梗死面積、IL-1及TNF-α

本文通過奧扎格雷聯(lián)合依達(dá)拉奉治療大鼠急性腦缺血再灌注的研究顯示，二者聯(lián)合對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷有保護(hù)作用，可以改善大鼠神經(jīng)功能，減少梗死面積，降低腦組織中IL-1，TNF-α的含量，其機(jī)制可能與其抑制了IL-1，TNF-α的表達(dá)有關(guān)。

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