匹魯卡品癲癇模型慢性期大鼠海馬苔蘚纖維出芽的觀察

陳麗麗 黃 靚妹 詹 紅艷 曹亦賓

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型是研究癲癇的重要手段。研究發(fā)現(xiàn)，腹腔注射匹魯卡品(pilocarpine，PILO)是誘導(dǎo)癲癇發(fā)作的一種簡(jiǎn)單方便的動(dòng)物模型［1，2］。PILO通過(guò)同時(shí)激動(dòng)乙酰膽堿和谷氨酸受體導(dǎo)致大鼠癲癇發(fā)作。發(fā)作后可引起分為3個(gè)階段的行為和腦電圖變化:急性期:邊緣性癲癇持續(xù)狀態(tài)(status epilepsy，SE)可持續(xù)至24 h;靜止期:腦電圖(EEG)和行為基本正常，4～42 d;慢性自發(fā)性復(fù)發(fā)性發(fā)作(spontaneous recurrent seizures，SRS):類似于復(fù)雜部分性發(fā)作的患者，每只動(dòng)物發(fā)作2～3次/周［3］。長(zhǎng)期發(fā)作可引起類似人類顳葉癲癇的病理改變，如神經(jīng)元缺失、膠質(zhì)細(xì)胞增生、苔蘚纖維出芽等［4，5］。因此，該模型已作為理想的動(dòng)物模型之一，用于癲癇的實(shí)驗(yàn)研究。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性成年Wistra大鼠60只，體重200～250 g，由河北聯(lián)合大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)部提供。隨機(jī)分為2組，癲癇模型組(模型組)30只;0.9%氯化鈉溶液對(duì)照組(對(duì)照組)30只。均進(jìn)行Nissl染色及Timm銀染。

1.2 藥品 PILO由美國(guó)SIGMA公司提供，硝酸銀由廣州市立新化工廠生產(chǎn)，戊巴比妥鈉由北京化工廠生產(chǎn)，焦油紫(Crestyl Violet)由美國(guó)SIGMA公司生產(chǎn)，氫醌由湖北大學(xué)化工廠生產(chǎn)。

1.3 動(dòng)物模型制作 大鼠腹腔注射PILO 350 mg/kg，注入前30 min腹腔注入東莨宕堿1 mg/kg，以拮抗其外周膽堿能反應(yīng);注射后根據(jù)Racine［6］制定的標(biāo)準(zhǔn)判定是否有癲癇發(fā)作，并于實(shí)驗(yàn)當(dāng)天行EEG檢查。對(duì)照組大鼠腹腔注等量0.9%氯化鈉溶液，觀察有無(wú)癲癇發(fā)作，也于實(shí)驗(yàn)當(dāng)天行EEG檢查。Racine標(biāo)準(zhǔn):0級(jí)無(wú)驚厥、Ⅰ級(jí)面部陣攣、Ⅱ級(jí)面部陣攣+節(jié)律點(diǎn)頭、Ⅲ級(jí)面部陣攣+節(jié)律點(diǎn)頭+前肢陣攣、Ⅳ級(jí)面部陣攣+節(jié)律點(diǎn)頭+前肢陣攣+后肢站立、Ⅴ級(jí)面部陣攣+節(jié)律點(diǎn)頭+前肢陣攣+后肢站立+跌倒。

1.4 灌注和取材 模型組及對(duì)照組用于Nissl染色的大鼠分別于給藥后3、7、10、30、60 d 灌注取材;用于 neo-Timm 染色的大鼠分別于 3、7、10、30、60 d 灌注取材。

1.5 Nissl染色 切片置于二甲苯中脫脂3 min后依次放入100%、95%、70%乙醇各3 min加水，蒸餾水漂洗3 min，0.1%Crestyl Violet染色10～20 s，鏡下觀察背景呈白色或無(wú)色;而后依次放入70%、95%、100%乙醇各1～2 min脫水，再移入二甲苯透明至少5～10 min后，中性樹(shù)膠封片;Olympus光學(xué)顯微鏡觀察，并拍照。半定量評(píng)估CA1、CA3、門區(qū)神經(jīng)細(xì)胞丟失程度，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)［7］0:無(wú)損害;1:1% ～10%神經(jīng)元缺失，伴輕度軸突變性;2:11% ～50%細(xì)胞缺失，伴相當(dāng)多的纖維變性;3:超過(guò)50%的細(xì)胞缺失，伴密集延長(zhǎng)的軸突變性。

1.6 Timm銀染 將50%阿拉伯膠60 ml檸檬酸緩沖液10 ml、5.6%氫醌 30 ml、17%硝酸銀 1.5 ml于暗室中混合均勻［8］;暗室中將干燥切片浸入新鮮配制的孵育液后，置26℃水浴箱中孵育1 h以上后，傾去孵育液，流水沖洗15～20 min;切片干燥后，行Nissl復(fù)染(同前)，中性樹(shù)膠封片;光鏡下行齒狀回顆粒上區(qū)Timm銀染苔蘚纖維出芽評(píng)分，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)［9］見(jiàn)表1。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件，每只大鼠的各項(xiàng)數(shù)據(jù)均采用盲法對(duì)每只動(dòng)物的5張切片進(jìn)行平均后產(chǎn)生，計(jì)量資料以±s表示，半定量評(píng)分比較采用秩和檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 顆粒上區(qū)苔蘚纖維出芽Timm銀染顆粒評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

2 結(jié)果

2.1 動(dòng)物行為學(xué)觀察及腦電圖 模型組:PILO給藥的30只大鼠中，1只死于癲癇持續(xù)狀態(tài)，其余大鼠均可觀察到邊緣性發(fā)作行為表現(xiàn)，即豎立、奔跑、濕狗樣抖動(dòng)，繼發(fā)以面部自動(dòng)癥如眨眼、咀嚼及點(diǎn)頭。按Racine標(biāo)準(zhǔn)，Ⅱ～Ⅲ級(jí)發(fā)作2只，Ⅳ～Ⅴ級(jí)發(fā)作26只，未發(fā)作1只，每次發(fā)作持續(xù)約40 s，連續(xù)5～24 h。給藥3 d后及60 d內(nèi)行為表現(xiàn)呈慢性復(fù)發(fā)性癇性發(fā)作，Ⅱ～Ⅲ級(jí)，2～3次/周，表現(xiàn)為前腭陣攣、咀嚼，單肢陣攣等，每次持續(xù)約20～30 s。模型成功率為93%。Ⅳ級(jí)以上腦電圖均可見(jiàn)癲癇波(圖1)。對(duì)照組:腹腔注射0.9%氯化鈉溶液，30只大鼠未觀察到邊緣性發(fā)作行為表現(xiàn)及癲癇發(fā)作。

2.2 Nissl染色 正常大鼠CA3、CA1區(qū)有大量致密錐體細(xì)胞，齒狀回門區(qū)有中等量神經(jīng)元。本研究對(duì)照組各區(qū)神經(jīng)元未見(jiàn)丟失與變形，與正常大鼠無(wú)差別。PILO注射3 d后，CA3區(qū)錐體細(xì)胞大量缺失伴細(xì)胞變性，CA1區(qū)錐體細(xì)胞也開(kāi)始缺失;7 d后，可以觀察到顆粒細(xì)胞發(fā)散并持續(xù)30 d，同時(shí)CA1區(qū)變性;30 d后，門區(qū)和CA1區(qū)可見(jiàn)大量膠質(zhì)細(xì)胞增生;60 d時(shí)更明顯(圖2)。模型組各區(qū)神經(jīng)元缺失情況。見(jiàn)表1。

表1 模型組海馬各區(qū)神經(jīng)缺失程度評(píng)分比較 分(張)

2.3 Timm銀染 正常情況下，海馬苔蘚纖維(mossy-fibre，MF)終止于CA3區(qū)錐體層和門區(qū)神經(jīng)元，并有大量Timm顆粒分布，齒狀回顆粒上區(qū)只有極少量Timm顆粒分布。本研究所有對(duì)照組大鼠切片顆粒上區(qū)均未見(jiàn)苔蘚纖維著色，也未見(jiàn)Zn2+標(biāo)記的苔蘚纖維末梢增加(圖3)。模型組PILO注射10 d后，多數(shù)大鼠門區(qū)觀察到富含Zn2+的苔蘚纖維并伸向CA3區(qū)，并可見(jiàn)單獨(dú)的苔蘚纖維穿過(guò)顆粒細(xì)胞后進(jìn)入內(nèi)分子層，但與同期對(duì)照組染色無(wú)差別;30 d后幾乎所有大鼠內(nèi)分子層均見(jiàn)富含Zn2+的苔蘚纖維末梢;60 d后，苔蘚纖維出芽非常明顯，內(nèi)分子層可清楚地看到含Zn2+末梢并形成異常帶，分子層外2/3未見(jiàn)Timm顆粒帶形成(圖4)。模型組與對(duì)照組苔蘚纖維出芽Timm銀染顆粒評(píng)分比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(u=－3.365，P＜0.05)。見(jiàn)表2。

3 討論

3.1 神經(jīng)元丟失 正常海馬結(jié)構(gòu)中CA1和CA3區(qū)主神經(jīng)元為錐體細(xì)胞，齒狀回主神經(jīng)細(xì)胞為顆粒細(xì)胞，門區(qū)主神經(jīng)元為中間神經(jīng)元。從CA1經(jīng)CA3至門區(qū)，神經(jīng)元形態(tài)和電生理特點(diǎn)呈連續(xù)變化過(guò)程，細(xì)胞自發(fā)放電增加，抑制性中間神經(jīng)元的作用逐漸減弱。而齒狀回顆粒細(xì)胞則不同，生理?xiàng)l件下齒狀回具有防止癲癇樣電活動(dòng)在海馬網(wǎng)絡(luò)中的發(fā)生的作用。大量實(shí)驗(yàn)證明成年動(dòng)物癲癇持續(xù)狀態(tài)可引起海馬CA1、CA3區(qū)和齒狀回門區(qū)神經(jīng)元的丟失，齒狀回顆粒上區(qū)和CA1區(qū)錐體下層顆粒細(xì)胞軸突(苔蘚纖維)外生(出芽)［10，11］。本研究觀察了大鼠腹腔注射PILO后海馬各區(qū)神經(jīng)元的丟失情況。結(jié)果表明齒狀回門區(qū)神經(jīng)元、CA3錐體細(xì)胞大量丟失伴膠體細(xì)胞增生，CA1區(qū)錐體細(xì)胞少量丟失伴輕度變性及顆粒細(xì)胞發(fā)散，該結(jié)果與Cllifford等［4］研究基本一致。研究認(rèn)為，海馬CA1區(qū)和齒狀回富含膽堿受體，CA3區(qū)和門區(qū)富含谷氨酸能受體，而癲癇發(fā)作后神經(jīng)元丟失最嚴(yán)重的卻是CA3區(qū)，其次是門區(qū)。神經(jīng)元丟失可能是通過(guò)特異性遞質(zhì)受體(谷氨酸受體)介導(dǎo)，因?yàn)楣劝彼峥梢鹕窠?jīng)元樹(shù)突的腫脹，神經(jīng)細(xì)胞體的水腫及變性。

表2 苔蘚纖維出芽Timm銀染顆粒評(píng)分 分(張)

圖1 癲癇模型組腦電圖

圖2 PILO注射60 d門區(qū)神經(jīng)元缺失伴膠質(zhì)細(xì)胞增生

圖3 癲癇對(duì)照組顆粒上區(qū)Timm銀染

圖4 PILO注射60 d顆粒上區(qū)Timm銀染

3.2 苔蘚纖維出芽 正常齒狀回苔蘚纖維起自顆粒細(xì)胞層，進(jìn)入門區(qū)，其分支形成密集的網(wǎng)絡(luò)。門區(qū)的軸突就近傳至CA3區(qū)，終止于腔隙層而形成纖維束，在Timm銀染時(shí)表現(xiàn)為Timm顆粒。光鏡下見(jiàn)到的Timm顆粒已由電鏡證實(shí)位于超微結(jié)構(gòu)的突觸末端［8］。苔蘚纖維出芽是指在內(nèi)分子層形成的神經(jīng)可塑性改變，在切片上可見(jiàn)表現(xiàn)為Timm銀染著色區(qū)的改變。齒狀回內(nèi)分子層苔蘚纖維出芽是顳葉癲癇患者和顳葉癲癇動(dòng)物模型一種重要的神經(jīng)可塑性變化［12］。本實(shí)驗(yàn)中，PILO注射后10 d，可見(jiàn)單獨(dú)的苔蘚纖維穿過(guò)顆粒細(xì)胞層進(jìn)入內(nèi)分子層;30 d后，幾乎所有大鼠內(nèi)分子層均見(jiàn)富含Zn2+的苔蘚纖維末梢;60 d后，在內(nèi)1/3分子層形成異常帶。切片上表現(xiàn)為Timm銀染著色區(qū)域的變化，由苔蘚纖維出芽和突觸重建產(chǎn)生。Tang等［13］研究表明，齒狀回門區(qū)苔蘚細(xì)胞的丟失與苔蘚纖維出芽有關(guān)，齒狀回門區(qū)神經(jīng)元是一組對(duì)興奮性毒性易損性神經(jīng)元，由不同的神經(jīng)元群組成，其中最主要的是苔蘚細(xì)胞，苔蘚細(xì)胞死亡，使得內(nèi)分子層顆粒細(xì)胞樹(shù)突的突觸后位點(diǎn)空隙，刺激了苔蘚纖維并形成新的興奮突觸環(huán)路，該環(huán)路產(chǎn)生正反饋而引起自發(fā)性癲癇發(fā)作。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在PILO模型中，神經(jīng)元丟失、癲癇持續(xù)狀態(tài)、苔蘚纖維出芽的密度和自發(fā)性癲癇發(fā)作的頻率有明確的相關(guān)性［14］。更進(jìn)一步研究結(jié)果表明，中度海馬苔蘚(MF)出芽可由未產(chǎn)生神經(jīng)元損害的短期發(fā)作引起，而紅藻氨酸(KA)或點(diǎn)燃模型中見(jiàn)到的嚴(yán)重苔蘚纖維出芽可能是由長(zhǎng)期的發(fā)作活動(dòng)和神經(jīng)元缺失共同產(chǎn)生。

綜上可見(jiàn)，腹腔注射匹魯卡品簡(jiǎn)單復(fù)制了人類癲癇的基本病理特征，是研究癲癇的一種簡(jiǎn)便方法。

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