二十二碳六烯酸對視網(wǎng)膜光感受器細胞超微結(jié)構(gòu)影響的實驗研究

艾 明，孫 明，2，李 岱

(1.武漢大學(xué)人民醫(yī)院，湖北 武漢 430060;2.咸寧學(xué)院五官醫(yī)學(xué)院)

視網(wǎng)膜色素變性(retinitis pigmentosa，RP)是一種以視網(wǎng)膜光感受器細胞漸進性凋亡以及死亡為特征的遺傳性致盲性眼病，且多為雙眼發(fā)病。目前，全世界約有一百多萬人罹患此病［1］，至今缺少有效的治療方法。而二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid，DHA)作為人體必需的高度不飽和脂肪酸，近年來它在促進大腦突觸細胞及視網(wǎng)膜光感受器細胞的發(fā)育方面?zhèn)涫荜P(guān)注。國外已有研究［2］證實:DHA缺乏可導(dǎo)致視覺電生理的改變，視網(wǎng)膜電圖反應(yīng)異常。我們通過觀察DHA對RP動物模型視網(wǎng)膜光感受器細胞電鏡下形態(tài)的影響，為進一步探討防治RP的新途徑提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品及儀器

DHA軟膠囊(美國紐曼斯藻油DHA軟膠囊嬰幼兒裝，100mgDHA/粒)，生理鹽水，脫脂牛奶，MNU(美國Sigma公司，避光保存，臨用前用生理鹽水配至5g/L)，2.5%戊二醛，1%鋨酸，日立H—600型透射電鏡(日本日立公司)。

1.2 實驗動物及分組

生后35d的清潔級雌性Sprague-Dawley(SD)大鼠共14只，由華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院動物中心提供，平均體質(zhì)量(100±5)g，排除眼和全身疾病。將所有動物隨機分為3組。A組:正常組，2只;B組:造模組，6只;C組:DHA組，6只。

1.3 實驗方法

1.3.1 給藥方法

將DHA軟膠囊內(nèi)的藻油抽出，按40mg/kg/d的量給 DHA組大鼠灌胃［3］，先將量好的藻油DHA與脫脂牛奶混合，再灌入大鼠胃內(nèi);造模組灌入同樣量的脫脂牛奶。每日上午8點給藥。

1.3.2 建立動物模型

灌胃15d后將造模組和DHA組SD大鼠按40mg/kg的劑量一次性腹腔注射 MNU［4］。正常組大鼠經(jīng)腹腔注射同劑量的生理鹽水。造模后每日同時間點繼續(xù)給藥。分別在注射MNU后12h、24h、48h用頸椎脫臼法處死動物，取出眼球。

1.3.3 透射電鏡觀察

將取出的眼球在2.5%戊二醛中固定1周后，改用1%鋨酸固定，梯度酒精脫水，環(huán)氧樹脂包埋，做超薄切片，日立H-600透射電鏡觀察。

2 結(jié)果

同正常對照組相比，MNU造模后各時間點造模組大鼠視網(wǎng)膜光感受器細胞均發(fā)生核深染，染色質(zhì)濃縮，出現(xiàn)凋亡細胞，外節(jié)膜盤疏松卷曲腫脹。隨造模時間的延長，視網(wǎng)膜的破壞越嚴重。造模后第48h，見光感受器細胞明顯稀疏、凋亡;而DHA組大鼠視網(wǎng)膜光感受器細胞結(jié)構(gòu)均接近正常(見圖1)。

圖1 大鼠視網(wǎng)膜光感受器細胞及外節(jié)膜盤電子顯微鏡像

3 討論

目前，RP的發(fā)病機制仍不十分清楚，但其病理過程已經(jīng)證實為視網(wǎng)膜光感受器細胞的漸進性凋亡，因此，開發(fā)抑制光感受器細胞凋亡的藥物，延緩RP的病程，是一倍受關(guān)注的研究方向。

DHA是人體內(nèi)不飽和程度最高的必需脂肪酸之一，它不能由自身產(chǎn)生，主要是從食物中直接獲?。?］，尤以鮭魚(沙丁魚)中含量最為豐富。DHA的作用及其廣泛，不僅具有抗衰老、抗神經(jīng)炎性反應(yīng)，另外還對黃斑變性、阿爾茲海默病、帕金森病以及其它一些神經(jīng)變性性疾病都有預(yù)防作用［6］。Hoffman DR 等［7］將近幾年關(guān)于嬰幼兒補充DHA的隨機對照試驗匯集起來發(fā)現(xiàn):大多數(shù)研究表明嬰幼兒的視功能與飲食中DHA的含量密切相關(guān)，食用DHA含量高的配方奶的嬰兒其視覺誘發(fā)電位(VEP)要比食用不含DHA配方奶的嬰兒表現(xiàn)更好，同時已經(jīng)有許多專家呼吁將配方奶中DHA的含量提高到母乳中的水平甚至更高。Rotstein等［8］也發(fā)現(xiàn)氧化劑百草枯加入培養(yǎng)的光感受器細胞中，能破壞線粒體膜的完整性，導(dǎo)致光感受器細胞發(fā)生凋亡;然而添加DHA后可以抑制光感受器細胞的凋亡。目前已經(jīng)有研究發(fā)現(xiàn)［9］DHA是通過在體內(nèi)被轉(zhuǎn)化為內(nèi)源性神經(jīng)保護介質(zhì)D1(NPD1)，進而行使它的神經(jīng)保護作用——誘導(dǎo)抗凋亡蛋白產(chǎn)生、抑制凋亡蛋白。

MNU對視網(wǎng)膜的損害恰恰是通過誘導(dǎo)光感受器細胞凋亡來實現(xiàn)的，一定量的MNU可以使光感受器細胞變小、染色質(zhì)濃縮［10］，這雖與人類RP的發(fā)病過程有所不同，但其原發(fā)部位及凋亡機制是相同的，有助于我們從微觀層面觀察DHA對視網(wǎng)膜光感受器細胞凋亡的影響。另有研究顯示［11］:MNU造模后12h，大鼠光感受器細胞見少量TUNEL細胞，造模后24h，陽性細胞達頂峰，隨后會逐漸下降［10］。因此，我們的實驗選擇造模后12h、24h、48h來觀察視網(wǎng)膜光感受器細胞在凋亡早期、高峰期、晚期的電鏡下形態(tài)。

本研究結(jié)果顯示:通過一次性腹腔注射一定劑量的MNU建立的RP動物模型，DHA在造模后的觀察時間點都可以有效抑制其光感受器細胞的凋亡。此外，DHA屬于營養(yǎng)類藥物，副作用少，且我們實驗中應(yīng)用的藻類DHA還具有純度高、不易氧化、易吸收等優(yōu)點。因此，DHA極有可能成為我們一直以來所尋找的可以延緩RP病程進展的有效藥物，但由于大鼠與人的種族差異性，有關(guān)DHA的最佳有效劑量、最大劑量等仍需進一步研究。

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