海洋活性酵母YS－185破壁技術(shù)的研究

郝建華，王躍軍，劉均忠，孫 謐

（中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所海洋酶工程室，山東 青島 266071）

紅酵母不僅含有豐富的蛋白質(zhì)、維生素，而且還能產(chǎn)生胡蘿卜素、蝦青素等天然物質(zhì)[1]。這些豐富的蛋白質(zhì)、纖維素和色素類物質(zhì)在紅酵母生長(zhǎng)代謝過(guò)程中都積累在細(xì)胞內(nèi)。紅酵母具有結(jié)構(gòu)復(fù)雜的細(xì)胞壁[2-4]，影響細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的釋放，其細(xì)胞壁對(duì)提高酵母利用率十分重要。目前已報(bào)道的破壁方法有物理破壁[5]、化學(xué)破壁[6]、生物破壁[7-11]等方法，這些破壁方法有各自的優(yōu)缺點(diǎn)。本研究以一株自行分離的海洋紅酵母為試驗(yàn)材料，采用酸堿法、珠磨法和酶溶法對(duì)其進(jìn)行破壁處理，探討其破壁效率，以期為將來(lái)高效利用海洋紅酵母提供技術(shù)支撐。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

海洋活性酵母YS-185，894堿性蛋白酶（活力單位13萬(wàn)U/g），中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所海洋酶工程室保存。

1.2 主要儀器

離心機(jī)：LC-6M型（上海市離心機(jī)械研究所）；752型紫外光柵分光光度計(jì)（上海分析儀器總廠）；BIOPHOT型Nikon相差顯微鏡（日本尼康公司）；Motics SFC-18型生物顯微鏡（麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司）；恒溫水浴鍋（北京西城區(qū)醫(yī)療器械廠）；KDL型珠磨機(jī)（瑞士WAB公司）。

1.3 酵母細(xì)胞酸堿法破壁

酵母細(xì)胞懸濁液在pH值3時(shí)于55℃處理36 h，然后將pH值調(diào)至12，繼續(xù)處理24 h，離心收集不容沉淀物，水洗2～3遍，噴霧干燥得酵母細(xì)胞壁。其中離心速度和時(shí)間均為400 r/min，15min。

1.4 酵母細(xì)胞珠磨法破壁

將培養(yǎng)好的海洋酵母細(xì)胞離心收集，取100 mg濕酵母細(xì)胞（干重約為15 mg）用冷去離子水清洗3遍后，移于試管中使其懸浮于濃度為0.1 mol/L、pH值為8.0的0.5 mL磷酸緩沖液中，按1∶1質(zhì)量比的比例添加玻璃珠，然后在漩渦混合儀上振動(dòng)，處理時(shí)間分別為1、2、3 h，并隔一段時(shí)間用冰浴進(jìn)行降溫。處理后的酵母細(xì)胞用冷去離子水清洗3遍，噴霧干燥得酵母細(xì)胞壁。

1.5 酵母細(xì)胞酶溶法破壁

在55℃下，酵母自溶6 h后，按400 mg/100g酵母液的添加量添加894堿性蛋白酶，pH值調(diào)至10.0于37℃下繼續(xù)酶解9 h后，煮沸5 min滅酶活，離心，水洗2～3遍，噴霧干燥得酵母細(xì)胞壁。

1.6 酵母細(xì)胞破壁率的評(píng)價(jià)

酵母細(xì)胞破壁率按公式α＝N1/（N1+N2）×100%計(jì)算。其中：α為酵母細(xì)胞破壁率；N1為顯微鏡下非正常形態(tài)的細(xì)胞數(shù)；N2為顯微鏡下形態(tài)正常的細(xì)胞數(shù)。在測(cè)定的時(shí)候隨即選取10個(gè)視野，進(jìn)行平均。

2 結(jié)果與分析

2.1 酸堿法破壁效果

酸堿法破壁雖然試驗(yàn)步驟簡(jiǎn)單易操作，但效果不理想，且一個(gè)操作周期比較長(zhǎng)，生產(chǎn)中不宜采用此法進(jìn)行破壁。從圖1中可知，細(xì)胞經(jīng)酸堿處理后無(wú)明顯變化，基本保持原形態(tài)，破壁率在10%左右。

圖1 酸堿法處理后的海洋酵母細(xì)胞

2.2 珠磨法破壁效果

珠磨法破壁選擇處理時(shí)間分別為1、2、3 h，機(jī)械破壁比較劇烈，能將細(xì)胞壁破碎，可以得到大小不一的細(xì)胞壁碎片，珠磨3 h后的酵母細(xì)胞破碎率比較高，碎片較多，顯微鏡下觀察珠磨法破碎海洋酵母細(xì)胞效果如下。

由圖2可以看出，珠磨破碎細(xì)胞1 h后，細(xì)胞部分破碎，細(xì)胞壁被處理成碎片，但破壁率不高（圖2-A）。珠磨2 h的破壁效果明顯好于前者，顯微鏡下觀察到的完整的酵母細(xì)胞已經(jīng)減少，碎片增多（圖2-B）。珠磨3 h后顯微鏡下觀察到的酵母細(xì)胞的完整細(xì)胞基本觀察不到，碎片比前兩者更多，破碎程度比較劇烈，破壁率為85%（圖2-C）。

圖2 珠磨法處理后的海洋酵母細(xì)胞

2.3 酶溶法破壁效果

酶溶法對(duì)海洋活性酵母進(jìn)行破壁，破壁效果較好。從圖3中可以看出，海洋酵母細(xì)胞已完全破壁，細(xì)胞已成空殼，但仍保持原形態(tài)，未被解離成碎片，破壁率為80%左右。

圖3 酶溶法破壁處理后的酵母細(xì)胞

3 討論

酸堿法、酶溶法、珠磨法對(duì)海洋酵母YS－185的破壁結(jié)果各異：經(jīng)酸堿法處理后的細(xì)胞破壁效果不佳，細(xì)胞基本保持原形態(tài)；酶溶法破壁率可達(dá)80%左右，破壁效果比較理想；珠磨法破碎程度較強(qiáng)，效果較好，所得碎片大小不一，但此種方法只適用于實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的細(xì)胞破碎，且后處理工作復(fù)雜，對(duì)于中試規(guī)模的批量生產(chǎn)采用此種方法不太合理，設(shè)備耗損太大，而且珠磨法所需設(shè)備尚不能國(guó)產(chǎn)，需要進(jìn)口，較為昂貴。因此，從操作規(guī)模、生產(chǎn)設(shè)備的限制、生產(chǎn)成本以及后處理工作等因素綜合考慮，酶溶法對(duì)海洋酵母細(xì)胞進(jìn)行破壁不僅效果理想，而且將來(lái)在大規(guī)模生產(chǎn)中也是可行的。

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