磺胺二甲嘧啶人工抗原合成及單克隆抗體制備

李君華，吳 萌，李春生，齊穎穎，張小兵，閆靜輝

（河北省科學(xué)院生物研究所，河北 石家莊 050081）

磺胺類藥物（Sulfonamides，SAS）是具有對氨基苯磺酰胺結(jié)構(gòu)的一類藥物的總稱，在食源性動物的飼養(yǎng)中，被作為獸藥廣泛應(yīng)用，在動物疾病防治方面具有顯著的療效[1]?；前范奏奏ぃ⊿ulfamethazine SM2），作為磺胺類藥物的一種，具有性質(zhì)穩(wěn)定、抑菌譜廣、毒性小、口服易吸收、價(jià)格低廉等特點(diǎn)，是畜牧業(yè)上應(yīng)用最廣泛、應(yīng)用量最大的藥物之一。但它在體內(nèi)的作用時間和代謝時間較長，易殘留在動物體內(nèi)，并可通過食物等途徑在人體中蓄積。藥物蓄積濃度超過一定值對人體機(jī)能是有害的，長期蓄積則會導(dǎo)致磺胺類藥物抗藥性的產(chǎn)生，造成耐藥菌的流行性感染，且有潛在的致癌性[2]。因此，歐盟對牛奶和肉類食品中的磺胺類藥物制定了最高允許值，即磺胺類藥物總量不得超過100 μg/kg，單個磺胺類藥物的濃度不得超過25 μg/kg[3]。2002年12月我國農(nóng)業(yè)部公告第235號文件規(guī)定：在所有食品動物的肌肉、脂肪、肝和腎中，磺胺類藥物最高殘留限量100 μg/kg，并將磺胺二甲嘧啶列為獸藥殘留監(jiān)控的重點(diǎn)[4]。

磺胺二甲嘧啶屬于小分子化合物，分子量為278.32，因?yàn)樾》肿颖旧聿痪哂姓T導(dǎo)產(chǎn)生抗體的能力，故必須將小分子與載體蛋白偶聯(lián)合成出人工完全抗原，才能誘導(dǎo)產(chǎn)生抗體。本文旨在利用重氮化法合成抗原，以此制備出效價(jià)高、特異性強(qiáng)的單克隆抗體，為該藥物的免疫學(xué)檢測方法的建立奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

SM2，磺胺二甲嘧啶（Sulfamethazine SMT），純度99%，Sigma；Sp2/0細(xì)胞（本研究室保存）；雌性BALB/c小鼠（河北實(shí)驗(yàn)動物中心）；牛血清白蛋白（Bovine Serum Albumen，BSA），卵清白蛋白（Ovalbumin，OVA），HAT、HT、福氏佐劑、PEG4000、免疫球蛋白亞型試劑盒，均購自Sigma；細(xì)胞培養(yǎng)板、DMEM培養(yǎng)基，購自GIBCO公司；HRP標(biāo)記羊抗小鼠IgG（北京中杉金橋生物科技有限公司）；亞硝酸鈉，氨基磺酸等試劑均為分析純。

1.1.1 儀器設(shè)備 酶聯(lián)免疫檢測儀（Tecan公司）；凝膠成像儀（SYNGENE）；CO2培養(yǎng)箱（SANYO）；倒置顯微鏡（Olympus）；U-3000紫外掃描儀（日本島津）；722型可見分光光度計(jì)（上海分析儀器廠）；紅外光譜儀（Thermo）。

1.2 方法

1.2.1 人工抗原合成 SM2-BSA完全抗原的合成采用重氮化法[5-6]并加以改進(jìn)。稱取55.6 mg的SM2溶于1 mL 1 mol/L的HCl中，并保持在4℃，稱取15 mg亞硝酸鈉溶于1 mL蒸餾水中，緩慢滴加入SM2溶液，邊滴加邊攪拌，保持pH值低于3。反應(yīng)結(jié)束后用氨基磺酸消耗過量的亞硝酸，用淀粉碘化鉀試紙檢測，直至滲圈從深藍(lán)色變成淺黃色為止。稱取50 mg BSA溶于2 mL 1 mol/L pH值為9.6碳酸鈉緩沖液中，即配成BSA溶液。在4℃放置1h后，將以上活化的SM2溶液逐滴加入BSA溶液中，反應(yīng)過程中保持pH值為9，在4℃攪拌反應(yīng)6 h后，用0.01 mol/L的PBS透析3 d，每天換液2次，即制備得SM2-BSA。SM2-OVA的制備亦按此方法。

1.2.2 人工抗原鑒定 SDS-PAGE鑒定：選擇分離膠濃度為12%，濃縮膠為5%，對合成物進(jìn)行SDSPAGE鑒定，并用紫外凝膠成像系統(tǒng)分析軟件估算BSA與SM2的偶聯(lián)比。

紫外光譜掃描（UV）鑒定：用PBS對SM2和BSA進(jìn)行適當(dāng)稀釋，測定BSA的蛋白濃度，把SM2-BSA稀釋到與BSA相同濃度，在220～400 nm波長下進(jìn)行紫外掃描[7]。并根據(jù)式（1）計(jì)算偶聯(lián)比[8]。

偶聯(lián)比=（SM2含量/SM2分子質(zhì)量）/（BSA含量/BSA分子質(zhì)量） （1）

紅外光譜（IR）鑒定：將 SM2、BSA、OVA、SM2-BSA、SM2-OVA的干粉與適量的KBr，在紅外燈照射下研磨、混勻后壓片，進(jìn)行紅外掃描。

1.3 單克隆抗體的制備及特性分析

1.3.1 單克隆抗體的制備 選用3只8周齡BALB/c小鼠，采用頸背部多點(diǎn)免疫，第一次免疫采用福氏完全佐劑，后面的免疫均采用福氏不完全佐劑，在免疫4次后，斷尾取血，用間接ELISA法測定效價(jià)，選取最佳免疫小鼠進(jìn)行融合[9-12]。取對數(shù)生長期的Sp2/0骨髓瘤細(xì)胞與免疫脾細(xì)胞，按常規(guī)方法進(jìn)行融合，采用間接競爭ELISA測定細(xì)胞上清液，篩選陽性孔，利用有限稀釋法對陽性孔進(jìn)行克隆化，建立穩(wěn)定分泌特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞株，液氮保存，并將擴(kuò)大培養(yǎng)的建株細(xì)胞注入致敏小鼠的腹腔，制備腹水。

1.3.2 單克隆抗體的特性分析 （1）SM2抗體的效價(jià)測定：采用間接ELISA法測定抗體的效價(jià)，用合成的SM2-OVA包被酶標(biāo)板，以P/N 2.1時的單抗稀釋倍數(shù)為此單抗的效價(jià)。（2）SM2抗體的敏感性測定[13]：采用阻斷ELISA測定SM2 mAb對SM2的半數(shù)抑制濃度（IC50），以 IC50衡量敏感性。（3）SM2 抗體的亞型測定[14]：用Sigma公司的免疫球蛋白亞型試劑盒進(jìn)行測定。（4）SM2抗體的親和常數(shù)測定[9]：采用非競爭酶免疫法測定SM2的親和常數(shù)。（5）SM2抗體的特異性測定：用阻斷ELISA測定SM2的2株抗體與磺胺對甲氧嘧啶、磺胺嘧啶、磺胺甲氧嗪、磺胺甲惡唑、磺胺六甲氧嘧啶、磺胺氯砒嗪等類似物的交叉反應(yīng)率。

2 結(jié)果與分析

2.1 SDS-PAGE鑒定結(jié)果

由圖1可知，SM2-BSA條帶滯后于BSA，且?guī)斡悬c(diǎn)散，明顯區(qū)別于BSA，說明偶聯(lián)成功。經(jīng)紫外凝膠成像系統(tǒng)分析軟件估算得：SM2-BSA的分子量為70KD，BSA的分子量為66.2KD，推算出偶聯(lián)比為：14∶1，OVA-SM2 的偶聯(lián)比為 10.5∶1。

圖1 SDS-PAGE鑒定結(jié)果

2.2 紫外光譜掃描鑒定

由圖2可知，BSA的最大吸收峰為278 nm，SM2的最大吸收峰為260 nm，SM2-BSA的最大吸收峰明顯向左偏移，在240nm處，說明偶聯(lián)成功。根據(jù)朗伯比爾定律（楊利國等）[8]，推算出偶聯(lián)比為：13∶1，驗(yàn)證了 SDS-PAGE 的結(jié)果。

圖2 紫外光譜掃描結(jié)果

2.3 紅外光譜掃描鑒定

由圖3～圖5可知，在600～1 600的波數(shù)范圍內(nèi)，將SM2-BSA和BSA的特征曲線相比較，有明顯不同，但與SM2的特征曲線有些相似，說明合成物中含有SM2。紅外光譜掃描的結(jié)果可以證明SM2偶聯(lián)到BSA上。

2.4 SM2單抗的效價(jià)測定

檢測原SM2-OVA以濃度0.5 μg/mL的包被量包板，采用間接ELISA法測定SM2單抗的上清及腹水的效價(jià)，如表1所示，4H4和3A12兩株腹水均具有較高的效價(jià)。

圖3 SM2紅外掃描譜圖

圖4 BSA紅外掃描圖

圖5 SM2-BSA紅外掃描圖

表1 SM2上清及腹水的效價(jià)測定

2.5 SM2抗體的敏感性測定結(jié)果

用阻斷ELISA法測定SM2抗體對不同濃度的SM2的抑制率，以抑制百分比B/B0（%）為縱坐標(biāo)，SM2濃度的Log值為橫坐標(biāo)，繪制SM2抗體的標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線。在0.5～40.5 ng/mL的范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，R2=0.996 2，3A12的 IC50為 0.6 ng/mL，表明對SM2具有較高的敏感性，見圖6。4H4的IC50為1.8 ng/mL，見圖7。

圖6 阻斷ELISA檢測SM2-3A12 IC50

2.6 SM2單抗的免疫球蛋白亞型測定

圖7 阻斷ELISA檢測SM2-4H4 IC50

用抗體亞型試劑盒進(jìn)行鑒定，4H4為IgG2a,3A12為 IgG1。

2.7 SM2單抗的親和常數(shù)測定

采用間接ELISA法測定SM2的親和常數(shù)，以抗體濃度的對數(shù)為橫坐標(biāo)，以O(shè)D值為縱坐標(biāo)，繪制 S 型曲線，K（3A12）=4.9×109L/mol，K（4H4）=8.3×108L/mol，這兩株抗體的親和力都較高。

2.8 SM2單抗的特異性測定

用阻斷ELISA法測定SM2的2株抗體與磺胺對甲氧嘧啶、磺胺嘧啶、磺胺甲氧嗪、磺胺甲惡唑、磺胺六甲氧嘧啶、磺胺氯砒嗪等類似物的交叉反應(yīng)率，CR（%）均小于 0.1%（表 2）。

表2 SM2與7種磺胺類交叉反應(yīng)結(jié)果

3 小結(jié)與討論

傳統(tǒng)的獸藥殘留分析主要是采用氣相色譜、高效液相色譜、質(zhì)譜等理化技術(shù)進(jìn)行定性、定量分析，這些方法結(jié)果準(zhǔn)確，但是存在前處理繁瑣、儀器昂貴、專業(yè)化要求高等不足。與之比較，微生物法操作簡便，但是特異性和靈敏度低。酶聯(lián)免疫方法是基于抗原抗體特異性的免疫反應(yīng)，靈敏度高，適用于大批量的樣品檢測，操作方便，對操作者的專業(yè)要求比較低[15]。本實(shí)驗(yàn)室通過重氮化法，合成制備了免疫原和檢測原，通過免疫篩選出了具有高特異、高敏感的抗SM2的細(xì)胞株。建立以單克隆抗體為基礎(chǔ)的藥物殘留檢測體系，進(jìn)而開發(fā)市場需要的藥物殘留ELISA檢測試劑盒，這些內(nèi)容需要在今后的工作中作進(jìn)一步的研究。

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