黃荊子乙酸乙酯提取物及其活性成分對(duì)人卵巢癌CoC1細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

鄧宇傲 謝宛玉 李秀云 曹建國(guó)

1．廣東省暨南大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院深圳市人民醫(yī)院婦科，廣東 深圳 518020;2．湖南省南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科，湖南 衡陽(yáng) 421001;3．湖南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410006

卵巢癌是婦科腫瘤中病死率最高的疾病，上皮來(lái)源的卵巢癌5年存活率僅為39%［1］。黃荊子 (Vitex negundo seed)為黃荊的果實(shí)，藥理學(xué)研究證實(shí)黃荊子提取物具有廣泛的藥理作用。近年來(lái)，其抗腫瘤作用引起了人們的極大興趣。木脂素 (lignan)是自然界中廣泛存在的一類物質(zhì)，具有抗腫瘤，抗病毒，調(diào)節(jié)激素平衡，抑制血小板活化因子 (PAF)，抗氧化，護(hù)肝及抗炎等生理功能，尤其是抗腫瘤作用目前備受關(guān)注。本文對(duì)黃荊子乙酸乙酯提取物EVn－50及從中分級(jí)分離獲得的4種木脂類化合物進(jìn)行體外抗人卵巢癌研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株 人卵巢癌CoC1細(xì)胞系購(gòu)于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心。

1.1.2 藥品 注射用DDP凍干粉劑:齊魯制藥有限公司生產(chǎn)，批號(hào):6030052DB;

黃荊子乙酸乙酯提取物EVn－50及從中分級(jí)分離獲得的四種化合物Comp 6、Comp 7、Comp 8、Comp 10均由中南大學(xué)藥學(xué)院周應(yīng)軍博士惠贈(zèng)，四種化合物由中南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定為木脂類。

1.1.3 試劑 臺(tái)盼蘭、二甲基亞砜 (DMSO)、RPMI－1640培養(yǎng)基為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品;新生小牛血清由杭州四季青生物工程材料有限公司生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 黃荊子提取物的配制 稱取EVn－50及各化合物各2.5mg，用10μL DMSO溶解后，加入PBS分別配成0.5mg/ml的母液5ml;經(jīng)0.45μm濾菌膜過(guò)濾后，再在無(wú)菌條件下將濾液經(jīng)過(guò)0.22μm濾菌膜過(guò)濾除菌，密封包裝后置于4℃冰箱中保存，臨用前按所需濃度稀釋。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) 用含10%小牛血清的RPMI 1640，置5%CO2、37℃、飽和濕度條件下培養(yǎng)，每2－3天傳代一次。

1.2.3 細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢測(cè)EVn－50及木脂類化合物對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

1.2.3.1 細(xì)胞存活率測(cè)定

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期CoC1細(xì)胞，用完全培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為2.0×104/mL，以1mL/孔接種于6孔培養(yǎng)板中，分別加入100μL受試物，使其終濃度為0.1，1.0，10.0μg/mL;DDP終濃度為0.02，0.2，2.0μg/mL;溶媒對(duì)照組加入相同體積終濃度為0.02%DMSO的完全培養(yǎng)基。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，孵育48h，臺(tái)盼藍(lán)染色后，顯微鏡下計(jì)數(shù)拒染活細(xì)胞數(shù)。計(jì)算公式:細(xì)胞存活率=處理組的活細(xì)胞均數(shù)/空白對(duì)照組活細(xì)胞數(shù)×100%;細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率 (%)=(1－細(xì)胞存活率)×100%。

1.2.3.2 生長(zhǎng)曲線的繪制

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期CoC1細(xì)胞，用完全培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為2.0×104/mL，以1mL/孔接種于6孔培養(yǎng)板中，加入100μL/孔受試物，使其終濃度為1.0μg/mL，DDP終濃度為0.2μg/mL;溶酶對(duì)照組加入相同體積終濃度為0.02%DMSO的PBS，每濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔。每天臺(tái)盼藍(lán)染色后，分別計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)，連續(xù)計(jì)數(shù)4天，經(jīng)3人盲法計(jì)數(shù)，取平均數(shù)，以每次所得的細(xì)胞平均數(shù)為縱坐標(biāo)，時(shí)間為橫坐標(biāo)繪制生長(zhǎng)曲線圖。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

計(jì)量資料數(shù)據(jù)采用x±SD表示，均重復(fù)3次以上。采用SPSS Windows for 11.5軟件分析并繪制圖形。

2 結(jié)果

2.1 量效關(guān)系檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示 EVn－50及黃荊子木脂類化合物能降低人卵巢癌CoC1細(xì)胞存活率，呈濃度依賴性;其中，以Comp 8、EVn－50效價(jià)較高，IC50分別為 1.40μg/mL、1.56μg/mL(圖1)。

2.2 時(shí)效關(guān)系檢測(cè)

臺(tái)盼藍(lán)染色后細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果顯示:EVn－50及黃荊子木脂類化合物能有效降低人卵巢癌CoC1細(xì)胞活細(xì)胞數(shù)目，呈時(shí)間依賴性;其中，以Comp 8、EVn－50作用較強(qiáng)，繪制生長(zhǎng)曲線圖 (圖2)。

3 討論

黃荊系被子植物馬鞭草科牡荊屬植物，黃荊的果實(shí)即黃荊子。黃荊子提取物具有抗炎、解熱鎮(zhèn)痛、抗氧化、抗菌、降血糖、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌、免疫等作用［2－3］。近年來(lái)，黃荊子提取物的抗腫瘤作用引起了人們的極大興趣，據(jù)報(bào)道，黃荊子提取物對(duì)人肺癌細(xì)胞 (PC－12)、人結(jié)腸癌細(xì)胞(HCT116)、人口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞 (KB)、人乳腺癌細(xì)胞(MCF －7)［4］及人宮頸癌細(xì)胞 (Hela)［5］等多種腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)有顯著抑制作用。

研究證實(shí)木脂類是一類具有廣譜抗腫瘤活性的天然物質(zhì)，且該類化合物中的鬼臼毒素 (Podophyllotoxin)的衍生物已在臨床上得到較廣泛的應(yīng)用。以鬼臼毒素為母體的半合成衍生物依托泊甙 (VP－16，etoposide)和替尼泊甙(VM－26，teniposide)已于1983年經(jīng)美國(guó)FDA批準(zhǔn)用于應(yīng)用于臨床，對(duì)于小細(xì)胞肺癌、前列腺癌、膀胱癌、睪丸癌、卵巢癌、腦瘤等惡性腫瘤的治療均取得了顯著的療效。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，EVn－50及木脂類化合物Comp 8對(duì)人卵巢癌CoC1細(xì)胞的生長(zhǎng)具有顯著抑制作用，呈濃度及時(shí)間依賴性;Comp 8在0.1、1.0、10.0μg/mL濃度時(shí)對(duì)CoC1細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率分別為17%、55%、70%，IC50值為1.40μg/mL;EVn－50在 0.1、1.0、10.0μg/mL 濃度時(shí)對(duì)CoC1細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率分別為19%、50%、69%，IC50值為1.56μg/mL，與陽(yáng)性對(duì)照藥物順鉑比較無(wú)顯著差異。據(jù)此，我們認(rèn)為黃荊子乙酸乙酯提取物EVn－50及由其分級(jí)分離獲得的Comp 8在體外能顯著抑制人卵巢癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，木脂類化合物是該提取物中抗人卵巢癌的活性成分，這為研究黃荊子提取物及其活性成分的抗腫瘤作用提供初步實(shí)驗(yàn)依據(jù)。黃荊子乙酸乙酯提取物及木脂類化合物在體治療卵巢癌的有效性及其作用機(jī)制等有待進(jìn)一步探討。

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