Aβ 16-22聚集及海藻糖抑制其聚集過程的毛細(xì)管電泳檢測(cè)

徐 亮，孫 彬，都文婕，董曉燕

(天津大學(xué)化工學(xué)院，天津 300072)

Aβ 16-22聚集及海藻糖抑制其聚集過程的毛細(xì)管電泳檢測(cè)

徐 亮，孫 彬，都文婕，董曉燕

(天津大學(xué)化工學(xué)院，天津 300072)

淀粉質(zhì)β(amyloid β，Aβ)多肽是阿爾茲海默癥(Alzheimer’s disease，AD)的致病蛋白，其疏水核心Aβ 16-22具有重要的研究?jī)r(jià)值．以Aβ 16-22為模型多肽，利用毛細(xì)管電泳檢測(cè)方法，分析了Aβ 16-22在水溶液和海藻糖溶液中的聚集過程．結(jié)果表明，毛細(xì)管電泳法不僅能夠很好地分離Aβ 16-22聚集過程中單體和部分聚體，實(shí)現(xiàn)對(duì)多肽聚集過程的快速鑒定和分析，同時(shí)也可檢測(cè)海藻糖對(duì)Aβ 16-22聚集的抑制作用．研究結(jié)果可為Aβ聚集抑制劑的高通量篩選和AD治療中的快速診斷提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)．

淀粉質(zhì)β(Aβ)多肽；Aβ 16-22；毛細(xì)管電泳；海藻糖；抑制劑；聚集

朊病毒、Ⅱ型糖尿病以及帕金森綜合征和阿爾茲海默癥(Alzheimer’s diseases，AD)都與蛋白質(zhì)的非正常折疊及其形成的淀粉樣沉淀物有關(guān)[1]．其中AD又稱進(jìn)行性老年癡呆癥，是一種普遍的年齡依賴性癡呆癥．隨著社會(huì)人口老齡化的發(fā)展，如果缺乏有效的預(yù)防和治療AD的手段，AD患者將急劇增加．

AD的一個(gè)主要病理現(xiàn)象是在腦組織神經(jīng)細(xì)胞外，淀粉質(zhì)β(amyloid β，Aβ)多肽單體聚集成有毒的寡聚體和纖維狀結(jié)構(gòu)，進(jìn)而形成老年斑沉積[2]．目前對(duì)于治療和預(yù)防AD的方法主要集中在抑制Aβ多肽的聚集方面[3]，因此，建立一種快速、簡(jiǎn)捷的檢測(cè)Aβ多肽聚集過程的方法，對(duì)于研究Aβ聚集的抑制機(jī)理以及篩選Aβ聚集抑制劑，將有十分重要的意義[2-4]．

毛細(xì)管電泳(capillary electrophoresis，CE)法具有高柱效、快速、易于自動(dòng)化以及樣品和緩沖液消耗量少的特點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于生物分子分離與分析中[5]．近年也有關(guān)于應(yīng)用CE進(jìn)行Aβ聚集情況的分離分析的報(bào)道[6-9]．例如，Sabella等[8]用CE方法研究了Aβ多肽1-40和Aβ 1-42在水溶液中的聚集過程，這種方法可以觀測(cè)到Aβ多肽的聚集過程．Kato等[9]基于CE的方法，采用熒光檢測(cè)器，建立了分析Aβ 1-42聚集形成的原纖維以及纖維的方法，并用該方法考察了幾種小分子物質(zhì)對(duì)Aβ 1-42聚集生成原纖維及纖維的抑制情況．但由于Aβ多肽聚集過程形成的寡聚體既無(wú)內(nèi)源熒光又很難標(biāo)記熒光物質(zhì)，故無(wú)法用熒光檢測(cè)，因此該方法不能用于檢測(cè)寡聚體，也無(wú)法篩選其抑制劑．而研究證明，Aβ多肽聚集過程形成的寡聚體具有更高的細(xì)胞毒性[10]．

筆者采用毛細(xì)管電泳法研究了Aβ,16-22的聚集過程，觀察了Aβ,16-22聚集過程中單體及聚體的實(shí)際分離效果，考察了Aβ,16-22在水溶液中的聚集情況，并研究了海藻糖對(duì)Aβ,16-22聚集過程的抑制作用．開發(fā)的方法和得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)于快速篩選Aβ聚集的抑制劑具有重要的指導(dǎo)意義．

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

目前普遍認(rèn)為，Aβ多肽的聚集是導(dǎo)致AD的主要原因，而Aβ多肽包括Aβ 1-39、Aβ 1-40、Aβ 1-41以及Aβ 1-42多種[3,9](多肽序列參見圖1)，其中Aβ 16-22是上述所有Aβ多肽均含有的多肽片段，它被認(rèn)為是Aβ的疏水核心，在Aβ的構(gòu)象轉(zhuǎn)變中起關(guān)鍵作用[11-13]．因此該片段的聚集性質(zhì)在某種意義上決定了整個(gè)Aβ的聚集特性，能夠有效抑制該片段聚集的抑制劑，有可能抑制整個(gè)Aβ多肽的聚集．雖然迄今已有大量研究者通過分子動(dòng)力學(xué)模擬考察了該片段的聚集過程[14-16]，但關(guān)于該片段的實(shí)驗(yàn)研究卻鮮有報(bào)道．

圖1 Aβ多肽序列以及聚集示意Fig.1 Sequence of Aβ peptides and schematic diagram for its aggregation

實(shí)驗(yàn)所用Aβ 16-22購(gòu)自吉爾生化(上海)有限公司，其氨基酸序列為N-Ac-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-NH2，通過C18反相柱液相色譜法檢測(cè)其純度為98.99%，相對(duì)分子質(zhì)量為894.09．該肽段N端用乙?；揎棧珻端用氨基修飾．六氟異丙醇(HFIP)購(gòu)自Sigma公司．超濾膜(截留分子質(zhì)量3,000,Da)購(gòu)自北京欣經(jīng)科生物技術(shù)有限公司．所用毛細(xì)管(50,μm)購(gòu)自河北省永年銳灃色譜器件有限公司．所用的其他實(shí)驗(yàn)材料均購(gòu)自天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司．

1.2 儀 器

毛細(xì)管電泳儀購(gòu)自美國(guó)貝克曼公司，儀器型號(hào)為P/ACETMCapillary Electropharosis MDQ．

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 Aβ 16-22樣品的準(zhǔn)備

將Aβ 16-22溶于純的HFIP中，配成1.0,mg/mL的溶液，冷凍干燥后，放置在-20,℃冰箱中凍存待用[8]．實(shí)驗(yàn)中，上述處理的Aβ 16-22先配成10,mg/mL的DMSO溶液，待Aβ 16-22充分溶解后，再加入20倍于DMSO體積的水或海藻糖溶液(pH＝7.0)，充分溶解．將溶解好的樣品用0.22,μm的膜過濾，一部分移入毛細(xì)管電泳儀的樣品管，其余的密封后室溫培養(yǎng)，屆時(shí)取樣進(jìn)行透射電鏡的檢測(cè)．

1.3.2 用毛細(xì)管電泳法檢測(cè)Aβ 16-22聚集體

在實(shí)驗(yàn)中，毛細(xì)管柱的有效長(zhǎng)度為20,cm(進(jìn)樣端到檢測(cè)窗口的長(zhǎng)度)、總長(zhǎng)30.2,cm．所有毛細(xì)管均經(jīng)過NaOH及HCl預(yù)處理后使用，詳細(xì)的管柱處理方法可參見文獻(xiàn)[17]．在進(jìn)行毛細(xì)管電泳分離實(shí)驗(yàn)時(shí)，首先用pH＝5.0～10.0的40,mmol/L的磷酸緩沖液對(duì)剛?cè)芙獾臉悠愤M(jìn)行分離，分離電壓為10,kV．隨后用流動(dòng)相為40,mmol/L、pH＝2.3的磷酸鹽溶液，以及含有1.0,mmol/L海藻糖的40,mmol/L、pH,＝2.3的磷酸鹽溶液對(duì)多肽樣品進(jìn)行分離分析，分離電壓為-20,kV．在所有毛細(xì)管電泳實(shí)驗(yàn)中，控制毛細(xì)管溫度為17,℃，進(jìn)樣條件為2.1,kPa、4,s，檢測(cè)波長(zhǎng)200,nm．進(jìn)樣前，樣品和流動(dòng)相都要經(jīng)過脫氣處理；每次進(jìn)樣結(jié)束后先用過膜水沖洗毛細(xì)管，然后用0.5,mol/L的NaOH沖洗毛細(xì)管，再用水沖洗；之后用緩沖液平衡，待電流和基線穩(wěn)定后，再次進(jìn)樣．分別進(jìn)行了Aβ 16-22在水溶液以及1.0,mmol/L海藻糖溶液中培養(yǎng)不同時(shí)間的樣品的毛細(xì)管電泳分析．

1.3.3 透射電鏡成像法觀測(cè)不同培養(yǎng)條件的Aβ 16-22聚集體

分別取少量在水中和1,mmol/L海藻糖溶液中培養(yǎng)8,d的Aβ 16-22樣品，超聲15,min使其分散均勻后，取10,μL滴于帶有碳支持膜的銅網(wǎng)上，使樣品在銅網(wǎng)上停留1,min，用濾紙吸去多余的溶液，再用過膜水沖洗銅網(wǎng)10,s后，用濾紙吸去多余的水分．銅網(wǎng)上的樣品用磷鎢酸負(fù)染色(2,g磷鎢酸，溶解到100,mL的水中，再用0.22,μm的膜過濾)染色30,s，吸去多余的染色液，在室溫下晾干．將干燥后的樣品放入Tecnai,G2,F20場(chǎng)發(fā)射透射電子顯微鏡系統(tǒng)，抽真空5,min，在200,kV加速電壓下觀察，拍照．

2 結(jié)果與討論

2.1 Aβ 16-22聚集過程的毛細(xì)管電泳檢測(cè)分析

Aβ 16-22為Aβ多肽的疏水核心，其疏水性較強(qiáng)，故其水溶性較差，所以實(shí)驗(yàn)中采用DMSO作為助溶劑．本研究使用的毛細(xì)管柱為最常使用的熔融石英毛細(xì)管柱，該毛細(xì)管柱內(nèi)壁具有較高的硅羥基濃度，硅羥基的pKa值在2.0左右，故當(dāng)pH＞2.0時(shí)，毛細(xì)管內(nèi)壁帶有負(fù)電荷，管內(nèi)可產(chǎn)生正向電滲流[18]．文獻(xiàn)[17]報(bào)道，管內(nèi)電滲流隨pH值的增加而逐漸增大．而毛細(xì)管電泳可以使用電滲流為推動(dòng)力，分析物在電滲流的推動(dòng)下由進(jìn)樣端運(yùn)動(dòng)到檢測(cè)窗口處得以檢測(cè)．因此筆者首先選用pH＝5.0～10.0的緩沖液考察了Aβ 16-22樣品的出峰情況．結(jié)果表明，在所用的pH條件下得到的電泳圖中均有一信號(hào)較強(qiáng)、峰寬約為1.0,min的峰，經(jīng)確定，該峰為助溶劑DMSO的吸收峰．圖2給出了pH＝7.0時(shí)毛細(xì)管電泳分離剛配置的Aβ 16-22樣品的實(shí)驗(yàn)結(jié)果．由圖2可知，DMSO的峰值及峰寬遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于多肽樣品峰，故部分多肽樣品峰可能與DMSO峰重合，無(wú)法得到準(zhǔn)確的多肽樣品分析結(jié)果．因此，欲對(duì)此多肽樣品精確分析，需排除助溶劑DMSO對(duì)多肽峰的影響．

圖2 多肽樣品的毛細(xì)管分離圖譜Fig.2 Capillary electropherogram separation of peptide sample

參考McCormick[19]分離多肽及蛋白質(zhì)所用的流動(dòng)相，筆者采用pH 較低的流動(dòng)相(pH＝2.3)對(duì)樣品進(jìn)行了分析．采用此流動(dòng)相，管內(nèi)電滲流較低(電滲流值為0.19×10-8,m2/(V·s))，約為pH＝7.0時(shí)電滲流的1/15，多肽在毛細(xì)管內(nèi)根據(jù)自身的泳動(dòng)作用，從進(jìn)樣端泳動(dòng)到檢測(cè)窗口處可得以分析檢測(cè)．而DMSO不帶電荷，故其無(wú)法移動(dòng)到檢測(cè)窗口處，這樣即可排除DMSO對(duì)樣品的干擾．

圖3為Aβ 16-22樣品從剛?cè)芙獾脚囵B(yǎng)3,d的毛細(xì)管電泳分離譜圖．圖3(a)為剛配置的Aβ 16-22樣品的毛細(xì)管電泳圖，圖中在5～6,min處有一主峰，定義為M峰，其峰高及峰面積在圖3(a)中最大．隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，M峰的峰高逐漸降低(見圖3(b)～(d))，而在M峰之前出現(xiàn)的峰，其峰高及峰面積逐漸增大，這必然是由于多肽在溶液中聚集所致．一般來說，在多肽的聚集過程中，單體會(huì)因逐漸聚集而濃度逐漸降低，聚體的濃度則會(huì)逐漸增加．根據(jù)上述分析初步可推斷圖3中M峰含有Aβ 16-22單體，M峰之前出現(xiàn)的峰為聚體．

圖3 Aβ 16-22在水中不同培養(yǎng)時(shí)間下的毛細(xì)管電泳Fig.3 Capillary electrophoregrams of Aβ 16-22 of different incubation time in water

另外，從圖3可見，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，含有Aβ 16-22單體的M峰的峰高及峰面積逐漸減小，而M峰之前表征聚體的峰的數(shù)目、峰高及峰面積均逐漸增大，尤其是在培養(yǎng)時(shí)間超過1,d后，M峰前出現(xiàn)吸收平臺(tái)，且隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，平臺(tái)高度不斷增大．平臺(tái)的出現(xiàn)可能是因?yàn)殡S著培養(yǎng)時(shí)間的增加，聚體的種類及含量不斷增加，部分聚體的峰重疊所致．平臺(tái)高度的增加說明聚體濃度不斷增大．本研究用毛細(xì)管電泳法只考察了3,d內(nèi)的聚集情況，這是因?yàn)榕囵B(yǎng)3,d后，樣品聚集程度進(jìn)一步增加，導(dǎo)致有肉眼可見的不溶物析出(無(wú)結(jié)果顯示)，無(wú)法用毛細(xì)管電泳法分離(含有不溶物的樣品進(jìn)行毛細(xì)管電泳分離時(shí)易使毛細(xì)管堵塞)．

如上所述，在圖3所用的電泳條件下，管內(nèi)的電滲流被屏蔽，分析物僅能靠自身的電泳作用從進(jìn)樣端泳動(dòng)至檢測(cè)窗口處；因此，分析物的出峰順序與它們的荷質(zhì)比大小順序一致，即荷質(zhì)比越大的物質(zhì)，泳動(dòng)速度越大，越先出峰．在圖3中聚體先于單體從毛細(xì)管內(nèi)泳動(dòng)出來，這說明聚體的荷質(zhì)比大于單體的荷質(zhì)比．這一結(jié)論與Sabella等[8]的報(bào)道中分析Aβ 1-40與Aβ 1-42的聚集情況得出的結(jié)論一致．在Sabella等的報(bào)道中，用pH＝7.4的磷酸緩沖液對(duì)不同培養(yǎng)時(shí)間的Aβ 1-40與Aβ 1-42樣品進(jìn)行了毛細(xì)管電泳分離檢測(cè)．在所用的實(shí)驗(yàn)條件下，毛細(xì)管內(nèi)有較強(qiáng)的電滲流，分析物在電滲流的推動(dòng)下由進(jìn)樣端運(yùn)動(dòng)到檢測(cè)窗口處，而樣品的泳動(dòng)方向與電滲流方向相反，即電泳圖中單體先于聚體出峰，說明單體的泳動(dòng)速度小于聚體的泳動(dòng)速度(樣品在管內(nèi)的運(yùn)動(dòng)方向與電滲流方向相同，與自身的電泳方向相反，故越先檢測(cè)到的峰的泳動(dòng)速度越小，荷質(zhì)比越小)[7]．

2.2 海藻糖對(duì)Aβ16-22聚集過程的影響

由第2.1節(jié)可知，用毛細(xì)管電泳法可觀測(cè)不同培養(yǎng)時(shí)間的Aβ 16-22的聚集過程，因此隨后研究了海藻糖對(duì)Aβ 16-22聚集過程的影響．首先用1.0 mmol/L海藻糖溶液溶解Aβ 16-22樣品，為了避免樣品在進(jìn)行毛細(xì)管電泳時(shí)的組成變化，也向緩沖液中加入了1.0,mmol/L海藻糖．圖4(a)為剛配置樣品的毛細(xì)管電泳圖．由圖可見，在有海藻糖存在的情況下，剛?cè)芙獾臉悠分兄挥蠱峰出現(xiàn)，與沒有加入海藻糖的樣品相比(見圖3(a))，M峰之前沒有峰的出現(xiàn)．這說明，海藻糖在樣品溶解過程中即可抑制聚集，防止聚集體的產(chǎn)生．為了進(jìn)一步確認(rèn)M峰的成分，筆者參考了文獻(xiàn)[8]的方法，對(duì)樣品進(jìn)行了超濾(截留相對(duì)分子質(zhì)量為3,000)，并對(duì)超濾截留的樣品進(jìn)行了毛細(xì)管電泳法分離(分離條件與圖3相同)，確定M峰的相對(duì)分子質(zhì)量在3,000以內(nèi)(無(wú)結(jié)果顯示)，故可認(rèn)為M峰中含有Aβ 16-22的單體，進(jìn)一步驗(yàn)證了上述推測(cè)的正確性．為進(jìn)一步考察Aβ 16-22在海藻糖存在情況下的聚集情況，筆者隨后考察了延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間后Aβ 16-22的聚集情況．圖4(b)～(d)為培養(yǎng)1～3,d的聚集情況．由圖4可知，培養(yǎng)1,d時(shí)，電泳圖中2～3,min處，出現(xiàn)聚體峰．但隨著培養(yǎng)時(shí)間進(jìn)一步增加，電泳圖變化較?。畬?duì)比圖3和圖4可知，在有海藻糖存在的情況下，電泳圖中沒有出現(xiàn)因大量聚體生成而產(chǎn)生的峰平臺(tái)，這說明海藻糖可有效抑制Aβ 16-22聚集過程中聚體的生成．

圖4 Aβ 16-22在海藻糖溶液中的毛細(xì)管電泳Fig.4 Capillary electrophoregrams of Aβ 16-22 with different incubation time in trehalose solution

為進(jìn)一步證明海藻糖對(duì)Aβ 16-22聚集過程的抑制作用，用透射電鏡觀察了海藻糖的加入對(duì)Aβ 16-22聚集過程的影響．圖5為用透射電鏡觀察到的Aβ 16-22在水中和1.0,mmol/L海藻糖中培養(yǎng)8,d的聚集情況．可以看到，在不含海藻糖的培養(yǎng)物中(見圖5(a))，有大量Aβ 16-22聚集而成的纖維絲生成，這與文獻(xiàn)[20]中Aβ寡聚體的形狀相同；但在1.0,mmol/L海藻糖溶液中(見圖5(b))，沒有出現(xiàn)因多肽大量聚集而產(chǎn)生的纖維絲，而只有因少量聚集而產(chǎn)生的小顆粒生成，這說明海藻糖的加入能夠抑制Aβ 16-22的聚集．

圖5 Aβ 16-22在水和海藻糖溶液中培養(yǎng)8 d的透射電鏡照片F(xiàn)ig.5 TEM images of Aβ 16-22 incubated for 8 days in water and trehalose solution

以上結(jié)果均證明，在Aβ 16-22的聚集過程中，海藻糖起著重要的作用，合適濃度的海藻糖不僅能促進(jìn)Aβ 16-22的溶解，也能抑制Aβ 16-22的聚集．

3 結(jié) 論

(1)用毛細(xì)管電泳法考察了阿爾茲海默癥的致病Aβ多肽的疏水核心Aβ 16-22的聚集情況．研究了Aβ 16-22在水溶液中的聚集過程，并且考察了滲透劑分子海藻糖對(duì)其聚集過程的抑制作用．結(jié)果表明，毛細(xì)管電泳法能夠很好地分離Aβ,16-22聚集過程中單體和部分聚體；海藻糖能有效抑制Aβ 16-22聚集過程中聚體的生成．

(2)本文方法可用于快速觀測(cè)Aβ 16-22聚集過程，亦可用于篩選Aβ,16-22聚集的抑制劑，研究結(jié)果為Aβ聚集抑制劑的高通量篩選和AD治療中的快速診斷提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)．

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Aggregation of Aβ 16-22 Peptide and Its Inhibition Effect of Trehalose Studied Through Capillary Electrophoresis

XU Liang，SUN Bin，DU Wen-jie，DONG Xiao-yan
(School of Chemical Engineering and Technology，Tianjin University，Tianjin 300072，China)

Incidence of Alzheimer's disease(AD) is considered to be the result of the aggregation of amyloid β (Aβ) peptide in the brain. Aβ 16-22 is regarded as the central，hydrophobic core of Aβ peptide，and it is thought to be important in full length Aβ aggregation. Therefore，study on the aggregation of Aβ 16-22 possesses important research value. In this work，capillary electrophoresis was applied for the study of Aβ 16-22 aggregation in both water and trehalose solutions. Results show that，the Aβ 16-22 monomer and some peptide aggregates can be separated with the presented capillary electrophoresis method. Therefore，the aggregation process of the peptide can be monitored and detected. In addition，this methord can prove the effect of trehalose as an inhibitor on the Aβ 16-22 aggregation. The obtained results and presented method can not only provide a theoretical basis for the pathogenesis of AD，but also provide an experimental basis for the AD's rapid diagnosis and drug screening.

amyloid β(Aβ) peptide；Aβ 16-22；capillary electrophoresis；trehalose；inhibitor；aggregation

Q814.1

A

0493-2137(2011)07-0633-06

2009-11-03；

2010-05-15.

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(20876111)；國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(973計(jì)劃)資助項(xiàng)目(2009CB724705)；天津市自然科學(xué)重點(diǎn)基金資助項(xiàng)目(08JCZDJC17100).

徐 亮（1982— ），男，博士，tjuxuliang@yahoo.com.cn．

董曉燕，d_xy@tju.edu.cn..