鼻咽癌Survivin基因表達(dá)與預(yù)后關(guān)系的研究

蔡俊宏，符生苗*，涂志華，鄧立群，梁 茱，陳顯釗，龔選舉

（海南省人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)部1、放療科2、病理科3，海南 ?？?570311）

Survivin是1997年新發(fā)現(xiàn)的一種凋亡抑制基因[1]，定位于染色體17q25，為凋亡抑制蛋白家族(Inhibitor of apoptosis，IAPs)成員之一，可通過桿狀病毒IAP重復(fù)序列(Baculoviral IAP repeat，BIR)直接與半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)中的Caspase-3、Caspase-7等結(jié)合，參與抑制細(xì)胞凋亡的核心機(jī)制，使得細(xì)胞凋亡受到抑制。鼻咽癌（Nasopharyngeal Carciaoma，NPC）是我國南方和東南亞很常見的惡性腫瘤，至今發(fā)病機(jī)制仍不清楚，療效也不甚理想，5年生存率仍徘徊在50%～60%。本研究通過檢測鼻咽癌活檢組織中Survivin蛋白及mRNA的表達(dá)情況來探討凋亡抑制基因Survivin與鼻咽癌患者預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 44例研究病例均來自2006年5月至2007年9月海南省人民醫(yī)院耳鼻喉科門診患者鼻咽部活體組織檢查標(biāo)本，經(jīng)病理診斷確診，37例為低分化鱗狀細(xì)胞癌，7例為分化性非角化性癌，其中男30例、女14例，平均48歲(22～77歲)。臨床診斷分期按92福州分期，Ⅱ期11例，Ⅲ期18例，Ⅳ期15例。所有患者確診后均在我院放療科行放射治療，出院后隨訪至2010年10月。另取30例同期鼻咽部慢性炎癥組織做對照。

1.2 試劑 多聚賴氨酸玻片、兔抗人Survivin多克隆抗體、UltraSensitiveTMS-P免疫組化染色試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色試劑盒均購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。Survivin mRNA原位雜交試劑盒購自武漢博士德生物技術(shù)有限公司。

1.3 方法 Survivin蛋白免疫組織化學(xué)：采用SP法檢測，石蠟包埋組織標(biāo)本切片常規(guī)脫蠟水化、檸檬酸組織抗原修復(fù)液修復(fù)，內(nèi)源性過氧化物酶阻斷溶液室溫孵育10 min，正常非免疫動物血清室溫孵育10 min，兔抗人Survivin多克隆抗體4℃孵育過夜，生物素標(biāo)記二抗室溫孵育10 min，鏈霉菌抗生物素-過氧化物酶溶液室溫孵育10 min，DAB顯色、蘇木素復(fù)染、脫水透明、封片，顯微鏡觀察。Survivin mRNA原位雜交：石蠟包埋組織切片后按常規(guī)方法脫蠟水化、滅活內(nèi)源性酶、胃蛋白酶消化及1%多聚甲醛固定。39℃預(yù)雜交 2 h，39℃雜交過夜，37℃封閉 30 min，37℃生物素化鼠抗地高辛液反應(yīng)1 h，37℃鏈霉親和素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物（SABC）反應(yīng)20 min，室溫生物素化過氧化物酶孵育30 min，然后用DAB顯色、蘇木素復(fù)染、脫水透明、封片，顯微鏡觀察。在400×高倍顯微鏡下觀察腫瘤細(xì)胞5個視野，每個視野計(jì)數(shù)100個細(xì)胞，若鼻咽癌細(xì)胞漿或細(xì)胞核內(nèi)有棕黃色顆?；虬咂瑸殛栃约?xì)胞，計(jì)算陽性細(xì)胞占總的計(jì)數(shù)鼻咽癌細(xì)胞的百分率，＞50%為(+++)、26%～50%為(++)、6%～25%為(+)、≤5%為(-)，其中0%～25%為低表達(dá)，25%以上為高表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SAS8.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對4格表數(shù)據(jù)進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，兩組數(shù)據(jù)比較采用t檢驗(yàn)分析。

2 結(jié)果

2.1 鼻咽癌組織中Survivin的表達(dá)情況 Survivin蛋白的表達(dá)情況：9例(-)、5例(+)、10例(++)、20例(+++)，低表達(dá)共14例，高表達(dá)共30例。30例同期鼻咽部慢性炎癥組織中僅11例表達(dá)為(+)；Survivin mRNA原位雜交情況：11例(-)、6例(+)、13例(++)、14例(+++)，低表達(dá)共17例，高表達(dá)共27例。30例同期鼻咽部慢性炎癥組織中僅10例表達(dá)為(+)，見表1。且Survivin蛋白與mRNA水平表現(xiàn)出很好的一致性，同為陰性（9例）和同為陽性（32例）的比率達(dá)到90.9%。

表1 Survivin蛋白的表達(dá)與mRNA原位雜交情況（%）

2.2 Survivin基因表達(dá)的高低與鼻咽癌患者生存時間的關(guān)系 Survivin蛋白高表達(dá)的鼻咽癌患者平均生存時間為28.9個月，明顯低于Survivin蛋白低表達(dá)者的44.5個月；Survivin mRNA高水平的鼻咽癌患者平均生存時間為29.9個月，明顯低于Survivin mRNA低水平者的40.1個月，見表2。

表2 Survivin基因表達(dá)的高低與鼻咽癌患者生存時間的關(guān)系（±s）

表2 Survivin基因表達(dá)的高低與鼻咽癌患者生存時間的關(guān)系（±s）

檢測項(xiàng)目 表達(dá)高低 平均生存時間(月)P值Survivin蛋白 ＜0.01 Survivin mRNA高表達(dá)低表達(dá)高表達(dá)低表達(dá)28.9±11.7 44.5±3.6 29.9±12.4 40.1±10.8＜0.01

3 討 論

細(xì)胞凋亡在生理或病理?xiàng)l件下都會發(fā)生，細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)途徑在促細(xì)胞凋亡信號的刺激下線粒體會釋放細(xì)胞色素C，連接并激活凋亡蛋白酶激活因子，啟動凋亡效應(yīng)因子Caspase-9、Caspase-3和Caspase-7從而引起細(xì)胞凋亡[2]。在這個過程中Survivin可以直接抑制效應(yīng)因子Caspase-3、Caspase-7相關(guān)核心機(jī)制來阻止細(xì)胞的凋亡[3]。除此之外，Survivin還可阻礙線粒體釋放細(xì)胞色素C，與線粒體釋放的輔助性線粒體源性Caspase激活因子SMAC（Second mitochondria-derived activation of caspase）結(jié)合，保護(hù)IAPs免于被SMAC抑制，從而起到對Caspase的間接抑制作用。Survivin一般表達(dá)于人和哺乳動物的胚胎發(fā)育組織和人類大多數(shù)腫瘤組織中，而不表達(dá)在分化成熟的成人正常組織中[4-7]。Shin等[8]的研究表明Survivin是迄今發(fā)現(xiàn)最強(qiáng)的凋亡抑制因子，而其分子靶Caspase是細(xì)胞凋亡的核心機(jī)制，能夠級聯(lián)式激活并溶解蛋白，決定細(xì)胞凋亡的變化和趨勢。張帥等[9]運(yùn)用免疫組織化學(xué)和TUNEL法對51例鼻咽癌活檢組織標(biāo)本進(jìn)行Survivin蛋白及凋亡指數(shù)的相關(guān)研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在鼻咽癌組織中Survivin蛋白表達(dá)陽性率為82.4%，其中高表達(dá)占51%，凋亡指數(shù)平均為2.6%，Survivin蛋白表達(dá)與凋亡指數(shù)存在相關(guān)性，且與患者預(yù)后具有密切的相關(guān)性（P＜0.05）。本研究結(jié)果顯示，在44例鼻咽癌中Survivin蛋白表達(dá)陽性率為79.5%，其中高表達(dá)為68.2%，Survivin mRNA的表達(dá)陽性率75.0%，其中高表達(dá)為61.4%，與上述結(jié)果相近。本課題組應(yīng)用實(shí)時熒光定量RT-PCR方法檢測Survivin mRNA的表達(dá)，也發(fā)現(xiàn)鼻咽癌細(xì)胞株、鼻咽癌活檢組織組均較鼻咽部慢性炎癥組織高（P＜0.05），研究結(jié)果已另文發(fā)表[10]。這些研究結(jié)果提示凋亡抑制基因Survivin在鼻咽癌的發(fā)生、發(fā)展過程中具有調(diào)控腫瘤細(xì)胞凋亡的重要作用。

我們通過隨訪調(diào)查了入選研究組每位患者的生存狀態(tài)，進(jìn)一步研究Survivin基因表達(dá)與鼻咽癌患者預(yù)后之間的關(guān)系，從而討論Survivin作為鼻咽癌預(yù)后判斷指標(biāo)的可能性。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)Survivin蛋白高表達(dá)的鼻咽癌患者的平均生存時間為28.9個月，明顯低于低表達(dá)的44.5個月；Survivin mRNA高水平的鼻咽癌患者平均生存時間為29.9個月，明顯低于Survivin mRNA低水平者的40.1個月。Kato等[11]在食管癌中也發(fā)現(xiàn)Survivin低表達(dá)的病人平均生存時間為30個月，明顯高于Survivin高表達(dá)患者的9個月。對于鼻咽癌來說，盡管其對放射治療相對敏感，但鼻咽癌患者5年生存率仍只有50%～60%，其原因可能就是由于部分鼻咽癌細(xì)胞對放射治療存在放射抗拒。Asanuma等[12]證實(shí)了Survivin是胰管癌細(xì)胞產(chǎn)生放射抗拒的重要因素，而且在體外實(shí)驗(yàn)中Survivin mRNA的表達(dá)量與腫瘤細(xì)胞對放射的敏感性成反比，在亞致死劑量放射線下表達(dá)增強(qiáng)，說明Survivin也是一種誘發(fā)放療抗拒的重要因素。這些研究結(jié)果說明Survivin高表達(dá)可以明顯影響細(xì)胞凋亡，同時也可能是腫瘤細(xì)胞對放射治療產(chǎn)生放療抗拒和耐受性的重要原因。此外，徐澍等[13]還應(yīng)用免疫組織化學(xué)檢測了58例Ⅲ期鼻咽癌患者活檢組織p53蛋白表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)生存期＜5年者陽性率為82.1%，遠(yuǎn)高于＞5年者的31.6%。何俠等[14]還發(fā)現(xiàn)157例鼻咽癌標(biāo)中生存期＜3年者p16基因第2外顯子的缺失率為69.57%，明顯高于生存期＞3年者的29.10%（P＜0.01）。齊斌等[15]采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-連接酶檢測反應(yīng)(PCR-LDR)技術(shù)，檢測了203例晚期鼻咽癌初治患者活檢組織放化療通路或順鉑/氟尿嘧啶通路13個基因、18個SNP位點(diǎn)，用Kaplan-Meier法進(jìn)行生存分析，Cox回歸進(jìn)行多因素分析，發(fā)現(xiàn)有rs25487 AA、rs1136410 CC+TT、rs2032582 ATrs2010963 CC、rs3212986GG、rs2279744 GG+GT等6個基因型為預(yù)后的獨(dú)立危險因素(P＜0.05)。故而我們認(rèn)為Survivin主要影響細(xì)胞凋亡途徑中下游效應(yīng)因子Caspase-3、Caspase-7等，并與其他相關(guān)基因之間也可能有相互作用，但是它們之間的關(guān)系及鼻咽癌的確切發(fā)病機(jī)制如何，需要我們增加研究病例并延長隨訪時間進(jìn)一步的研究探討。

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