檉柳類鋅指基因ThZFL酵母誘餌表達(dá)載體的構(gòu)建及其表達(dá)驗(yàn)證1)

鄭唐春 王 英 臧麗娜 王亞軍 曲冠證 夏德安

(林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(東北林業(yè)大學(xué))，哈爾濱，150040)(嘉蔭縣林業(yè)局)(林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(東北林業(yè)大學(xué)))

檉柳(Tamarix hispida)是分布在干旱荒漠區(qū)域的一類常見(jiàn)的鹽生、旱生和沙生植物，具有良好的防風(fēng)固沙作用，通過(guò)對(duì)其進(jìn)行干旱、鹽脅迫處理提取RNA進(jìn)行RT－PCR分析，然后對(duì)獲得的檉柳cDNA文庫(kù)的測(cè)序及Blast比較分析，獲得了一個(gè)具有完整開放讀碼框的基因序列(GenBank No.EG971462)，因其與擬南芥的命名為 C2H2型鋅指蛋白(AT5G16470、AT3G02790、TAIR)的基因具有較高的相似性(氨基酸序列相似性約為80%)，并且通過(guò)對(duì)SwissProt數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行Blast未發(fā)現(xiàn)有相似的已知植物蛋白基因，因此可以認(rèn)為此基因?yàn)橐粋€(gè)新基因。此基因與來(lái)源于哺乳動(dòng)物的特定鋅指基因(ZFP706，Q9Y5V0)具有一定的相似性(氨基酸相似性22%)，因此暫時(shí)命名該基因?yàn)門hZFL(Tamarix hispida Zinc finger like gene)［1］。

鹽堿耐受性的應(yīng)答機(jī)制是受多基因表達(dá)互作調(diào)控的，例如各種各樣的相溶性溶質(zhì)或滲透劑，多胺類，活性氧分子和抗氧化劑的防衛(wèi)機(jī)制，離子運(yùn)輸和有害離子的區(qū)分［2］。多基因間復(fù)雜的相互作用導(dǎo)致的高效脅迫應(yīng)答系統(tǒng)機(jī)制尚不清楚，因此尋找相關(guān)蛋白之間的聯(lián)系，繪制蛋白質(zhì)相互作用圖譜就顯得格外重要。由Fields和Song［3］發(fā)明的酵母雙雜交系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)了在活體細(xì)胞內(nèi)驗(yàn)證蛋白質(zhì)間的相互作用。目的蛋白經(jīng)過(guò)在真核細(xì)胞中修飾加工后，更能體現(xiàn)其正常的生理活性，對(duì)研究此基因的具體生理功能提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

本試驗(yàn)以檉柳的cDNA文庫(kù)為模板，擴(kuò)增全長(zhǎng)的目的片段，構(gòu)建酵母誘餌表達(dá)載體pGBKT7－ThZFL，使其在酵母中穩(wěn)定表達(dá)。檢測(cè)其表達(dá)蛋白對(duì)酵母菌株所含的4種報(bào)告基因有無(wú)自激活作用及對(duì)酵母菌株自身是否有毒害作用，為下一步通過(guò)酵母雙雜交方法在檉柳cDNA文庫(kù)中篩選與ThZFL蛋白相互作用的蛋白奠定基礎(chǔ)，也為探究ThZFL基因在細(xì)胞中的生理功能和表達(dá)機(jī)制提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

檉柳cDNA由本實(shí)驗(yàn)室保存;E.coli DH5α感受態(tài)菌株購(gòu)自天根生化科技有限公司(北京);酵母雙雜交表達(dá)載體pG-BKT7－BD，對(duì)照質(zhì)粒 pGBKT7－53、pGBKT7－lam、pGAD－T，Y2Hgold和Y187酵母菌種，酵母省缺培養(yǎng)基及轉(zhuǎn)化試劑均購(gòu)自Clontech公司;質(zhì)粒提取、膠回收試劑盒購(gòu)自O(shè)MEGA公司(美國(guó));PCR相關(guān)試劑、DNA marker、pMD18－T載體、限制性內(nèi)切酶EcoR I、BamH I，T4 DNA連接酶購(gòu)自TaKaRa公司(日本);胰蛋白胨、酵母提取物、葡萄糖、YNB(無(wú)氨基酸酵母氮源)購(gòu)自 Amresco公司(美國(guó))，Yeastmaker Carrier DNA、X－αgal、3－AT等購(gòu)自Clontech公司(美國(guó));所用引物由英濰捷基貿(mào)易有限公司合成(上海);DNA序列由六合華大基因科技股份有限公司測(cè)定(北京);其他試劑為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 酵母誘餌載體的構(gòu)建

1.2.1 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)ThZFL基因序列(GenBank No.EG971462)，并結(jié)合酵母表達(dá)載體pGBKT7－BD讀碼框及多克隆位點(diǎn)自行設(shè)計(jì)引物，BLAST分析排除異源基因同源性序列，序列設(shè)計(jì):上游引物 Primer－F:5'－ATCGAATTCACGATGGCAGGAAAGGCGAAGCC－3'含有編碼區(qū)20個(gè)核苷酸，其中5'端含有EcoR I酶切位點(diǎn);下游引物 Primer－R:5'－AGCGGATCCTTAGATCTTCTTGAGGCTTCC－3'含有編碼區(qū)21個(gè)核苷酸，其中5'端含有BamH I酶切位點(diǎn)。

1.2.2 PCR 克隆目的基因

以檉柳cDNA為模板，進(jìn)行PCR克隆。反應(yīng)體系:cDNA 1 μL;10×PCR Buffer 2.5 μL;dNTP(10 mmol/L)2 μL;Primer－F(10 μmmol/L)2 μL;Primer－R(10 μmmol/L)2 μL;rTaqDNA聚合酶(5 U/μL)0.25 μL，加 ddH2O 至終體積 25 μL。反應(yīng)條件:94℃ 4 min、94℃ 30 s、56℃ 30 s、72℃ 1 min共35個(gè)循環(huán)，72℃ 7 min。取3 μL反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.2.3 PCR 產(chǎn)物連接 pMD18－T 載體

將PCR產(chǎn)物電泳后，用膠回收試劑盒回收目的條帶，然后與pMD18－T載體進(jìn)行連接，反應(yīng)體系:T4 DNA連接酶1 μL;10×T4 DNA 連接酶 buffer 1 μL;PCR 產(chǎn)物 4 μL;pMD18－T載體1 μL，加水至終體積10 μL。室溫過(guò)夜重組反應(yīng)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布到含有IPTG(24 mg/mL 10 μL)和 X－Gal(20 mg/mL 40 μL)的氨芐青霉素(Amp 50 μg/mL)LB平板上，37℃培養(yǎng)12～16 h，觀察藍(lán)白斑菌落。隨機(jī)挑取白色菌落，進(jìn)行菌液PCR再用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒PCR驗(yàn)證，驗(yàn)證完成后取菌液送北京六合華大進(jìn)行序列測(cè)定。

1.2.4 構(gòu)建酵母誘餌表達(dá)載體

對(duì)測(cè)序正確連有目的基因的pMD18－T載體和pGBKT7－BD空載體，用BamH I和EcoR I限制性內(nèi)切酶酶切，酶切體系:BamH I 2 μL;EcoR I 2 μL;10×K buffer 3 μL;質(zhì)粒 15 μL;ddH2O 9 μL?；靹蚝笙仍?0℃水浴鍋中恒溫處理3～4 h，期間每隔半個(gè)小時(shí)震蕩1次，然后轉(zhuǎn)到37℃水浴鍋中繼續(xù)恒溫處理3～4 h。酶切完成后用1%瓊脂糖凝膠電泳，用試劑盒膠回收酶切后的目的片段。然后進(jìn)行目的片段的連接重組，重組體系:T4 DNA連接酶1 μL;10×T4 DNA連接酶buffer 1 μL;目的片段6 μL;pGBKT7－BD 載體2 μL，終體積10 μL。16℃過(guò)夜連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布含有卡那霉素(Kana 50 μg/mL)的LB平板培養(yǎng)，37℃恒溫培養(yǎng)16～20 h。然后挑取單克隆進(jìn)行菌液PCR，提質(zhì)粒進(jìn)行質(zhì)粒PCR和酶切鑒定，最后將陽(yáng)性克隆送往北京六合華大基因有限公司測(cè)序鑒定。

1.2.5 酵母Y2Hgold感受態(tài)制備

購(gòu)買的酵母菌株為Y2Hgold，將凍存于－70℃的Y2Hgold劃線接種于新鮮的YPDA平板倒置于30℃孵育3～4 d，在15 mL的離心管中，加入3 mL的新鮮YPDA液體培養(yǎng)基，挑取2～3 mm的單克隆，震蕩混勻，在30℃，250 r/min中震蕩培養(yǎng)8～12 h;轉(zhuǎn)移5 μL培養(yǎng)液到50 mL(250 mL的培養(yǎng)瓶)新鮮的YPDA 中，繼續(xù)震蕩培養(yǎng)，直至 OD600達(dá)到0.15～0.30(約16～20 h);在室溫下，將酵母培養(yǎng)液700 g離心5 min，棄上清，用100 mL的YPDA液體培養(yǎng)基重懸，30℃溫育，使OD600達(dá)到0.4～0.5(約3～5 h);將培養(yǎng)液分到兩個(gè)50 mL的離心管中，700 g室溫離心5 min，棄上清，各用30 mL的滅菌的去離子水重懸;再700 g 室溫離心5 min，棄上清，各用 1.5 mL 1.1×TE/LiAc重懸;分裝于2個(gè)1.5 mL離心管中，高速離心15 s，棄上清，每管用600 μL 1.1×TE/LiAc重懸，至此感受態(tài)制備完成。

1.2.6 酵母誘餌載體轉(zhuǎn)化酵母Y2Hgold及其陽(yáng)性驗(yàn)證

酵母Y2Hgold感受態(tài)制備完成后，取兩個(gè)1.5 mL離心管中分別加入100 ng的pGBKT7－ThZFL載體和pGBKT7－BD空載體，再各加入5 μL(10 mg/mL)的變性的鯡魚精載體DNA，50 μL 的感受態(tài)細(xì)胞，500 μL 的 PEG/LiAc，輕輕震蕩混勻;在30℃水浴鍋中溫育30 min，每間隔10 min輕輕震蕩1次;然后每個(gè)管中加入20 μL的DMSO，混合均勻，放在42℃水浴中15 min，間隔5 min，輕輕震蕩1次;高速離心15 s，棄上清，用1 mL YPD plus液體重懸;繼續(xù)高速離心15 s，棄上清，用無(wú)菌的1 mL 0.9%NaCl液體重懸。按照1 ∶10，1 ∶100，1 ∶1 000 稀釋后，吸取100 μL，涂布 SD/－Trp平板，30℃倒置培養(yǎng) 3～4 d，觀察轉(zhuǎn)化情況。隨機(jī)挑取直徑大于2 mm的菌落進(jìn)行陽(yáng)性驗(yàn)證。

1.2.7 酵母誘餌載體的自激活作用驗(yàn)證

隨機(jī)挑取直徑大于2 mm的含有pGBKT7－ThZFL質(zhì)粒及對(duì)照空載體pGBKT7－BD單克隆，用20 μL無(wú)菌水重懸后，分別畫線于 SD/－Trp/X－α－gal、SD/－Trp/X－α－gal/AbA、SD/－Leu/－Trp/X－α－gal、SD/－Trp/－Leu/－His/X－α－gal培養(yǎng)基平板上，30℃培養(yǎng)3～5 d后觀察平板的生長(zhǎng)情況及菌落顏色變化，來(lái)檢測(cè)誘餌蛋白有無(wú)自激活作用。

1.2.8 酵母誘餌載體對(duì)酵母自身的毒性檢驗(yàn)

在經(jīng)陽(yáng)性驗(yàn)證的平板上挑取直徑大于2 mm的單菌落，分別接種與5 mL SD/－Trp(Kana 50 μg/mL)液體培養(yǎng)基中，30℃ 230～250 r/min，震蕩培養(yǎng)12 h，將過(guò)夜菌液以1∶100稀釋后接種于100 mL的 SD/－Trp(Kana 50 μg/mL)液體培養(yǎng)基中，在同樣條件下繼續(xù)培養(yǎng)，并分別于培養(yǎng)后 0、3、6、9、12、15、18、21、24、27、30 h 后吸取菌液3 mL，以新鮮的 SD/－Trp 液體培養(yǎng)基為空白對(duì)照，用可見(jiàn)光分光光度計(jì)在OD600處測(cè)定其吸光度，繪制酵母生長(zhǎng)曲線，分析誘餌蛋白對(duì)酵母細(xì)胞自身有無(wú)毒害作用。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴(kuò)增ThZFL基因編碼序列

以檉柳cDNA為模板進(jìn)PCR擴(kuò)增，取產(chǎn)物3 μL，在1%的瓊脂糖凝膠電泳，獲得1條亮帶，分子大小介于250～500 bp，與目的基因大小的318 bp相符(圖1)。

2.2 將目的條帶連接到pMD18－T載體

膠回收PCR產(chǎn)物，與pMD18－T載體連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌，獲得重組質(zhì)粒pMD18－T－ThZFL，首先對(duì)質(zhì)粒 pMD18－TThZFL進(jìn)行PCR檢驗(yàn)，然后用BamH I和EcoR I進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證，最后送樣到北京六合華大公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果分析表明所擴(kuò)增的目的片段和基因庫(kù)中的ThZFL基因序列(GenBank No.EG971462)完全一致，沒(méi)有發(fā)生堿基突變。

圖1 ThZFL基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳

2.3 酵母誘餌表達(dá)載體的構(gòu)建及驗(yàn)證

用 BamH I和 EcoR I對(duì)質(zhì)粒 pMD18－T－ThZFL、酵母空載體pGBKT7－BD同時(shí)進(jìn)行雙酶切后(圖2)，用T4連接酶連接后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，獲得重組載體暫命名為pGBKT7－ThZFL，提取質(zhì)粒PCR驗(yàn)證(圖3)，雙酶切目的條帶(圖4)，對(duì)菌液送樣測(cè)序。測(cè)序結(jié)果表明檉柳ThZFL基因已經(jīng)完全重組到酵母表達(dá)載體中，未發(fā)生堿基突變，至此酵母誘餌表達(dá)載體構(gòu)建完成。

圖2 重組質(zhì)粒pMD18－T－ThZFL和pGBKT7－BD的 BamH I和EcoR I雙酶切鑒定

圖3 誘餌質(zhì)粒pGBKT7－ThZFL PCR產(chǎn)物電泳

2.4 pGBKT7－ThZFL載體轉(zhuǎn)化酵母Y2Hgold菌株及陽(yáng)性驗(yàn)證

通過(guò)TE/LiAc法制備Y2Hgold酵母感受態(tài)，用PEG/LiAc法將誘餌載體轉(zhuǎn)化到酵母細(xì)胞中，涂布到SD/－Trp平板上篩選陽(yáng)性克隆，隨機(jī)挑取單菌落PCR，提取質(zhì)粒PCR，BamH I、EcoR I雙酶切驗(yàn)證，都在300 bp左右獲得目的條帶，表明pGBKT7－ThZFL質(zhì)粒已經(jīng)成功轉(zhuǎn)化到酵母細(xì)胞中(圖5)。

圖4 重組質(zhì)粒pGBKT7－ThZFL的BamH I和EcoR I雙酶切鑒定

圖5 誘餌表達(dá)載體pGBKT7－ThZFL轉(zhuǎn)化酵母后菌液PCR產(chǎn)物電泳

2.5 誘餌蛋白的自激活驗(yàn)證

酵母轉(zhuǎn)化涂板3 d后觀察平板發(fā)現(xiàn)，誘餌載體和空載體對(duì)照都在 SD/－Trp/X－α－gal上生長(zhǎng)，菌落顏色為白色，SD/－Trp/X－α－gal/AbA、SD/－Leu/－Trp/X－α－gal、SD/－Trp/－Leu/－His/X－α－gal平板上都未見(jiàn)菌落生長(zhǎng)，說(shuō)明酵母誘餌表達(dá)載體沒(méi)有自激活作用(表1)(圖6)。

表1 pGBKT7－ThZFL的自主激活作用的檢測(cè)

2.6 誘餌蛋白對(duì)自身的毒害作用

從單缺板上挑取的陽(yáng)性克隆，與空載體的對(duì)照菌在SD/－Trp液體培養(yǎng)基中，在30℃中震蕩培養(yǎng)，每隔3 h，吸取培養(yǎng)液測(cè)定OD600處的吸光度。數(shù)據(jù)結(jié)果表明，兩者在OD600處的吸光度隨時(shí)間先增長(zhǎng)后穩(wěn)定，但兩者生長(zhǎng)情況變化不顯著，整體生長(zhǎng)曲線相同，說(shuō)明重組誘餌載體pGBKT7－ThZFL對(duì)酵母自身沒(méi)有毒害作用(表2)。

圖6 在SD/－Trp/X、SD/－Trp/X/A、DDO/X平板上的自激活驗(yàn)證

表2 酵母誘餌載體pGBKT7－ThZFL和陰性對(duì)照載體pGBKT7－BD的生長(zhǎng)對(duì)比

3 討論

檉柳(Tamarix hispida)是干旱荒漠區(qū)域常見(jiàn)的沙生植物，除具有抗旱能力外，還普遍具耐鹽性。檉柳屬于典型的泌鹽性鹽生植物，泌鹽腺的分泌細(xì)胞內(nèi)含許多小的液泡，通過(guò)主動(dòng)運(yùn)輸將積累的鹽分儲(chǔ)存在液泡中而實(shí)現(xiàn)區(qū)隔化，維持細(xì)胞液中正常的滲透勢(shì)［4］。因此，從檉柳基因庫(kù)中尋找抗旱、抗鹽基因，研究植物的脅迫抗性具有重要意義。Wang Yucheng等［5］從檉柳中克隆到一個(gè)新的bZIP基因，在轉(zhuǎn)基因煙草中能增強(qiáng)過(guò)氧化酶(POD)和過(guò)氧化物歧化酶(SOD)的活動(dòng)，并增加可溶性糖與可溶性蛋白質(zhì)的含量。Guo Xiaohong等［6］從檉柳根系鹽脅迫cDNA文庫(kù)中，分離出一個(gè)編碼冷凍適應(yīng)蛋白基因ThCAP，轉(zhuǎn)基因楊樹對(duì)低溫具有較強(qiáng)的抵抗能力。最新研究表明，檉柳中的V－ATP酶亞基基因ThVHAc1，編碼由4個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的高級(jí)疏水蛋白。RT－PCR數(shù)據(jù)表明NaCl、NaHCO3、PEG和CdCl2脅迫能誘導(dǎo)該基因在檉柳的根、莖、葉中表達(dá)，在非脅迫條件下，脫落酸(ABA)的外源性應(yīng)用也能刺激ThVHAc1的轉(zhuǎn)錄水平，表明該基因參與ABA－依賴性脅迫信號(hào)途徑。另外，ThVHAc1轉(zhuǎn)酵母菌株能提高對(duì)鹽、干旱、紫外線、氧化劑、重金屬、冷凍和高溫耐性［7］。因?yàn)闄f柳生長(zhǎng)于環(huán)境惡劣的荒漠地區(qū)，在自然選擇的條件下，適應(yīng)嚴(yán)酷條件的抗性基因得到富集與積累，所以從檉柳基因組中探究新基因的生理功能具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值與生態(tài)意義。

植物鋅指基因是一類廣泛研究的抗逆性植物基因蛋白，廣泛分布在動(dòng)植物和微生物中。大量研究表明，一些鋅指蛋白與植物的抗逆性有關(guān)。例如:在胡椒中克隆到一個(gè)對(duì)氧化物、甲基紫精、過(guò)氧化氫和脫落酸等產(chǎn)生脅迫應(yīng)答反應(yīng)的新基因(CaAbsi1)，該基因可能在植物創(chuàng)傷和非生物脅迫產(chǎn)生的多基因應(yīng)答中發(fā)揮重要的作用［8］;研究人員還從菊花中分離到一個(gè)C2H2鋅指蛋白基因DgZFP，該基因在種子中可被NaCl、干旱、冷凍處理和微弱的ABA誘導(dǎo)，DgZFP的過(guò)表達(dá)能增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因煙草的耐鹽性［9］;Byung Kook Ham 等［10］還發(fā)現(xiàn)鋅指蛋白基因(Tsip1)，在煙草中過(guò)表達(dá)能提高其對(duì)水楊酸、乙烯、酸、鹽和病毒的耐性。最新研究發(fā)現(xiàn)，特殊的鋅指基因?qū)χ参锏纳L(zhǎng)和發(fā)育可能存在著致命的影響，在用CaMV 35S啟動(dòng)子過(guò)量表達(dá)編碼鋅指蛋白的AZF1和AZF3基因轉(zhuǎn)染擬南芥時(shí)，轉(zhuǎn)化效率非常的低，無(wú)法獲得任何轉(zhuǎn)基因植株［11］;Xu Shouming等［12］在研究檉柳的ThZF1基因在非生物脅迫下的功能時(shí)，嘗試著在CaMV 35S啟動(dòng)子下過(guò)量表達(dá)ThZF1基因轉(zhuǎn)染野生型擬南芥從而獲得轉(zhuǎn)基因擬南芥，但一直沒(méi)獲得轉(zhuǎn)基因苗。

酵母雙雜交是一種簡(jiǎn)便快速研究蛋白質(zhì)間相互作用的一種方法。與傳統(tǒng)的方法相比，其最大的優(yōu)勢(shì)在于不用分離純化蛋白質(zhì)，而是將所研究的基因置于真核酵母細(xì)胞體內(nèi)表達(dá)目的蛋白，從而為蛋白的功能修飾提供一個(gè)場(chǎng)所。通過(guò)酵母雙雜交技術(shù)，為研究蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)間的相互聯(lián)系提供了支持，蛋白關(guān)系圖譜變得越來(lái)越清晰，通過(guò)研究已知蛋白的功能，也能為探究新基因的生理功能提供理論依據(jù)。如將檉柳的Thprxl基因構(gòu)建到酵母誘餌表達(dá)載體，通過(guò)雙雜交篩選驗(yàn)證獲得了兩個(gè)與ThPrxl蛋白互作的蛋白，分別是油體鈣蛋白(ealciumlipid binding protein)和與 CONSTANS互作蛋白(CONSTANS interacting protein)［13］;以擬南芥的 HHP1 基因作為誘餌，從cDNA library中篩選到編碼ZFHD1(at1g69600)和ICE1(at3g26744)的基因，有趣的是ICE1和ZFHD1都參與冷凍和滲透脅迫的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)［14］;通過(guò)微陣列分析，發(fā)現(xiàn)水稻籽苗中的鋅指蛋白基因(ZFP179)能誘導(dǎo)OsDREB2A、OsP5CS、OsProT和OsLea3一系列基因表達(dá)，共同對(duì)NaCl、PEG 6000、ABA等脅迫處理產(chǎn)生應(yīng)答反應(yīng)，從而使轉(zhuǎn)基因水稻能增強(qiáng)抗氧化脅迫能力，活性氧清除能力，轉(zhuǎn)基因植物還能增加自由脯氨酸和可溶性糖的含量［15］。

前期研究結(jié)果證明ThZFL基因受鹽、滲透及冷脅迫等誘導(dǎo)，煙草的轉(zhuǎn)基因試驗(yàn)證明ThZFL基因的過(guò)量表達(dá)能提高煙草的耐鹽、抗?jié)B透等抗逆性，轉(zhuǎn)基因酵母也表明對(duì)低溫、NaCl、甘露醇和LiCl等脅迫有一定的應(yīng)答反應(yīng)。為進(jìn)一步探究ThZFL基因的生理功能，構(gòu)建了酵母誘餌表達(dá)載體，通過(guò)酵母雙雜交技術(shù)從檉柳cDNA文庫(kù)中篩選與之相互作用的蛋白和基因，參考對(duì)已知功能蛋白的研究，來(lái)推測(cè)并驗(yàn)證該基因的生理功能及抗性機(jī)理。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)cDNA PCR、雙酶切、基因重組、DNA測(cè)序等技術(shù)，成功將ThZFL基因構(gòu)建到酵母誘餌表達(dá)載體獲得轉(zhuǎn)化子pGBKT7－ThZFL，并成功轉(zhuǎn)化進(jìn)入酵母菌種Y2Hgold(含有真菌抗生素AbA(AnreobasidinA))，通過(guò)在SD/－Trp平板上篩選陽(yáng)性克隆及單克隆培養(yǎng)在液體SD/－Trp(Kana 50 μg/mL)培養(yǎng)基中獲得的生長(zhǎng)曲線，證明pGBKT7－ThZFL酵母載體對(duì)酵母自身沒(méi)有毒性作用。通過(guò)SD/－Trp、SD/－Trp/X、SD/－Trp/X/A、DDO、TDO 平板篩選，試驗(yàn)結(jié)果顯示轉(zhuǎn)化了誘餌載體的Y2Hgold酵母在SD/－Trp板上生長(zhǎng)，SD/－Trp/X板上生長(zhǎng)但不變藍(lán)，SD/－Trp/X/A板上不生長(zhǎng)，DDO、TDO平板上不生長(zhǎng)，證明誘餌蛋白沒(méi)有自激活功能，不能激活報(bào)告基因的表達(dá)。許多研究表明，鋅指蛋白具有核定位特征，并在酵母誘餌表達(dá)載體中具有自激活功能［16］，研究表明，此基因既不具有核定位特征，也不能激活酵母雙雜交系統(tǒng)中報(bào)告基因的表達(dá)，盡管ThZFL基因的同源基因在擬南芥中被標(biāo)注為鋅指基因，但實(shí)際上ThZFL基因完全不屬于鋅指蛋白基因家族，而是一個(gè)新基因［1］。以上數(shù)據(jù)為應(yīng)用酵母雙雜交技術(shù)篩選與誘餌蛋白相互作用的靶蛋白奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，有助于進(jìn)一步探究ThZFL基因的生理功能和抗逆機(jī)理。

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