氧化樂果中毒致肺損傷大鼠血清TNF-α濃度與肺組織TNF-α表達相關(guān)性的實驗研究

李孟秦 蔣智 曹小平

在發(fā)展中國家，急性有機磷殺蟲藥中毒（acute organ phosphorous pesticide poisoning，AOPP）是急診科常見的急危重癥之一[1]。重癥患者常因肺水腫、腦水腫、呼吸循環(huán)衰竭死亡。據(jù)統(tǒng)計，我國1995年AOPP患者的病死率高達12.8%。AOPP患者常并發(fā)肺損傷，肺水腫是重度AOPP患者最常見的并發(fā)癥[2]。AOPP所致肺水腫早期主要表現(xiàn)為肺間質(zhì)水腫，若繼續(xù)發(fā)展可進展為肺泡性肺水腫，終末期患者可因中樞性呼吸抑制、呼吸循環(huán)衰竭或多臟器衰竭而死亡，呼吸肌麻痹和肺水腫也可能為致死的主要原因[3]。TNF-α是最重要的炎癥因子之一，血清TNF-α濃度及測量方法簡便，本實驗研究目的為證實血清TNF-α濃度是否能間接反映肺組織TNF-α水平及肺損傷程度。

1 材料與方法

1.1 建立動物模型

選擇健康雄性SD大鼠（6周齡）150只，體重200～250g，隨機分成三組，A組為對照組，B組為染毒組。A組大鼠30只，B組60只。A組灌胃注射無菌生理鹽水，將B組以0.4%氧化樂果乳油工作液以45mg/kg灌胃染毒建立AOPP模型。以出現(xiàn)流涎、肌顫、呼吸困難、步態(tài)不穩(wěn)為標(biāo)準(zhǔn)選擇AOPP模型，剔除中毒癥狀不明顯以及死亡的個體。將實驗過程分為染毒后或生理鹽水30min、3h、6h、12h、24h、48h 6個觀察時點。

1.2 留取標(biāo)本

在對應(yīng)時間點分別于各組中隨機抽取5只大鼠，用頸椎脫臼法處死后摘取眼球放血，4℃靜置3h自然凝固，然后高速冷凍離心機5000rmp離心5min小心取上層血清放至-80℃冰箱內(nèi)備用；打開胸腔取出肺臟，用生理鹽水沖去表面血跡并用濾紙擦干并稱重，將雙肺分別用10%甲醛固定后脫水、包埋、切片。

1.3 肺系數(shù)測定

用公式肺濕重/體重×100%測定肺系數(shù)。將雙肺分別用10%甲醛固定后脫水、包埋、切片，左肺組織HE染色觀察肺泡及肺間質(zhì)形態(tài)變化，右肺切片以免疫組化染色后在200倍光鏡下拍照，用圖像處理軟件IPP6.0處理圖片計算光密度值，光密度值與TNF-α水平成正相關(guān)。用光密度值代表肺組織TNF-α水平。用ELISA法測定血清TNF-α濃度。

1.4 統(tǒng)計方法

所有計量資料均采用SPSS11.5統(tǒng)計軟件分析，用相關(guān)回歸分析A、B兩組大鼠的血清TNF-α濃度、肺TNF-α水平與肺系數(shù)相關(guān)性，血清TNF-α濃度與肺TNF-α水平相關(guān)性。

2 結(jié)果

2.1 實驗過程中大鼠的反應(yīng)及死亡數(shù)量

A組大鼠在實驗過程中無異常反應(yīng)，除處死對象外無死亡個體。B組大鼠在氧化樂果灌胃后10min均出現(xiàn)有機磷殺蟲劑中毒癥狀：流涎、肌肉震顫、步態(tài)不穩(wěn)、呼吸急促、腹瀉，癥狀于6h達高峰，12h后逐漸減輕，24h后癥狀消失。除處死個體外，B組大鼠死亡數(shù)為29只。

2.2 肺組織病理學(xué)改變

A組大鼠各時間點肺組織切片均正常。B組大鼠肺組織于染毒后30min～6h出現(xiàn)逐漸加重的肺間質(zhì)充血、肺泡間隔增寬，局部可見肺泡內(nèi)紅細(xì)胞聚集。12～48h上述變化逐漸減輕，但仍未恢復(fù)至正常。

2.3 血清與肺組織TNF-α表達以及肺系數(shù)的變化

對大鼠肺組織切片免疫組化結(jié)果進行分析，TNF-α表達的部位即圖片中棕黃色物質(zhì)的部分，主要位于肺間質(zhì)細(xì)胞質(zhì)中，部分細(xì)胞核也有表達。肺組織TNF-α水平越高，照片中棕黃色部分著色越深。用圖像處理軟件IPP6.0處理圖片計算光密度值，光密度值與TNF-α水平呈正相關(guān)。因此，用光密度值代表肺組織TNF-α水平。血清TNF-α濃度及肺系數(shù)變化見表1。

表1 大鼠血清TNF-α濃度、肺組織TNF-α水平及肺系數(shù)

2.4 TNF-α表達與肺系數(shù)相關(guān)性

血清TNF-α濃度與肺系數(shù)，肺組織TNF-α水平與肺系數(shù)，血清TNF-α濃度與肺組織TNF-α水平均呈正相關(guān)（相關(guān)系數(shù)r分別為0.93，0.91，0.96）。

3 討論

AOPP在農(nóng)藥中毒中發(fā)病率最高，重癥患者合并多器官功能衰竭的發(fā)病率、死亡率高，肺往往是最先受累的器官。有機磷殺蟲劑進入機體作為一種強烈的應(yīng)激原使機體產(chǎn)生一系列應(yīng)激反應(yīng)，刺激免疫系統(tǒng)釋放大量細(xì)胞因子如TNF-α、IL-1、IL-6，一旦水平異常增高則會損傷機體正常組織。TNF-α是早期主要的前炎癥因子之一，在內(nèi)毒素血癥試驗中，提前中和TNF-α的活性可阻斷其他細(xì)胞因子釋放[4]。

本實驗以氧化樂果灌胃染毒制造AOPP致肺損傷模型，灌胃后染毒大鼠出現(xiàn)毒蕈堿樣癥狀及煙堿樣癥狀。染毒大鼠肺系數(shù)增大、肺組織HE染色發(fā)現(xiàn)肺泡間隔增寬、肺泡內(nèi)紅細(xì)胞聚集及血清TNF-α濃度的增高，模型復(fù)制成功。本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)血清TNF-α濃度、肺組織TNF-α水平與肺系數(shù)呈正相關(guān)，血清TNF-α濃度與肺組織TNF-α水平呈正相關(guān)，說明血清TNF-α濃度可間接反映肺組織TNF-α水平以及肺損傷嚴(yán)重程度。

臨床中有大量有機磷中毒并發(fā)肺損傷患者，由于難以獲取標(biāo)本，通過肺組織檢查如病理學(xué)檢驗、免疫組化確定患者肺損傷的程度不現(xiàn)實。血清TNF-α濃度與肺組織TNF-α水平及肺損傷程度有良好的相關(guān)性，并且患者的血液標(biāo)本容易采集，因此可用血清TNF-α濃度來間接反映肺組織TNF-α水平及肺損傷的程度，從而為臨床上以血清TNF-α濃度評估有機磷中毒致肺損傷嚴(yán)重程度提供理論依據(jù)。

[1]王巧珍.69例急性有機磷農(nóng)藥中毒的急救與護理體會[J].當(dāng)代醫(yī)學(xué)，2010，16（21）：120-121.

[2]葉傳勇，陳佳山，蔣煒，等.597例急性有機磷農(nóng)藥中毒并發(fā)癥的臨床分析及搶救體會[J].中國危重病急救醫(yī)學(xué)，2001，13（6）：373-374.

[3]于潤江.中國內(nèi)科專家經(jīng)驗文集[M].沈陽：沈陽出版社，1993：923-933.

[4]Suffredini AF，Reda D，Bands SM，et al.Effects of recombinant diametric TNF receptor on inflammatory responses following intravenous antitoxin administration[J].J Immunol，1995，155（10）：5038-5045.