楊樹基因組SSR標(biāo)記在康定柳中的通用性分析

王紅莉，蒙嘉文，羅建勛* ，王朱濤，蔡應(yīng)君，任樹平

(1.四川省林科院，四川 成都 610081;2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，四川 雅安 625014;3.若爾蓋縣林業(yè)局，四川 若爾蓋 624500)

康定柳(Salix ParaplesiaSchneid)是楊柳科(Salicaceae)柳屬(Salix)落葉小喬木或灌木，為川西北高原特有鄉(xiāng)土樹種。近年來廣泛用于該地區(qū)防沙治沙，該樹種為雌雄異株，天然更新容易，群體內(nèi)雌雄個體數(shù)量相當(dāng)。為選出優(yōu)良防沙治沙種植材料，馮毅等［1］分別了研究5個群體遺傳多樣性。

簡單重復(fù)序列(SSR，Simple Sequence Repeat)也稱微衛(wèi)星DNA(Microsatellite DNA)或短串聯(lián)重復(fù)(Short Tandem Repeat，STR)，是近年來發(fā)展起來的基于PCR技術(shù)的一種新的分子標(biāo)記技術(shù)，同時，作為一種基于DNA長度多態(tài)性的分子標(biāo)記技術(shù)。SSR由2～4個多次串聯(lián)重復(fù)的核苷酸組成，廣泛分布于真核生物的基因組中［2］。SSR分子標(biāo)記因具有共顯性遺傳、高度多態(tài)性、重復(fù)性和穩(wěn)定性好、易于實(shí)現(xiàn)自動化等優(yōu)點(diǎn)［3］。在遺傳和物理圖譜構(gòu)建、基因定位、遺傳多樣性和物種進(jìn)化分析、親緣關(guān)系鑒定、DNA指紋圖譜構(gòu)建、比較基因組學(xué)、分子標(biāo)記輔助選擇育種等方面有著廣泛的應(yīng)用前景［4～6］。

SSR引物開發(fā)工作量大，操作復(fù)雜，并且需要了解一定的基因組序列信息，有研究表明:從一個基因組中分離出來的SSRs可以用于同科、同屬中其它個體［7，8］。這樣一來，不僅大大降低了開發(fā)成本，并且也使得SSR技術(shù)在種質(zhì)資源的研究方面得到更廣泛的應(yīng)用。本實(shí)驗(yàn)以川西高原地區(qū)特有的鄉(xiāng)土樹種——康定柳為材料，在楊樹基因組SSR標(biāo)記中篩選引物，分析其引物通用性，為下一步在DNA分子水平上通過SSR分子標(biāo)記探求康定柳雌雄群體間/內(nèi)遺傳多樣性、遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳分化，為生產(chǎn)上使用雌雄群體或混合群體防沙治沙遺傳穩(wěn)定性和成效提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本研究所采用的康定柳的5個群體分別來自四川省的紅原、若爾蓋紅星、阿壩、巴西和壤塘。每個群體采集雌雄單株各20株，共計(jì)200個個體。

本實(shí)驗(yàn)采用的622對SSR引物來源于楊樹SSR數(shù)據(jù)庫Populusmolecular genetics cooperative(http://www.ornl.gov/sci/ipgc/ssr_resource.htm)隨機(jī)抽取合成。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 康定柳基因組DNA的提取

采取CTAB法提取康定柳新鮮葉片的基因組DNA［9］。將其濃度最終定為 50 ng·μl－1～ 100 ng·μl－1。

1.2.2 PCR 反應(yīng)及產(chǎn)物檢測

從5個群體中隨機(jī)選取兩個個體，用622對引物分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

在以上能擴(kuò)增出條帶的引物的基礎(chǔ)上，分別從5個群體的雌雄群體中各隨機(jī)抽取一個樣，共計(jì)10個個體，進(jìn)一步進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

PCR反應(yīng)體系為:20 μl體系，DNA模板 0.5 μl，rTaqDNA 聚合酶 0.2 μl，10 × PCR buffer 2.0 μl，dNTPs 0.8 μl，上下游引物各 1.0 ul，滅菌蒸餾水14.5 μl。

PCR擴(kuò)增程序:95℃預(yù)變性3 min;30個循環(huán)(95℃ 變性 30 s，57℃ 退火 30 s，72℃ 延伸 30 s);72℃延伸10 min;4℃保存。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，溴化乙錠(EB)染色后對擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行記錄。

2 結(jié)果與分析

2.1 初篩

從5個群體中隨機(jī)選取兩個個體(來自不同群體的雌雄株)，用622對引物分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

622對引物對隨機(jī)選取的引物擴(kuò)增情況見表1。

表1 初篩引物統(tǒng)計(jì)表

其中兩對樣品都能擴(kuò)增出來的有105對，占實(shí)驗(yàn)總數(shù)的16.88%。

初步篩選中，引物可利用率達(dá)到16.88%。部分引物擴(kuò)增結(jié)果見圖1。

圖1 兩個樣品部分引物擴(kuò)增結(jié)果

2.2 復(fù)篩

在以上能擴(kuò)增出條帶的引物的基礎(chǔ)上，分別從5個群體的雌雄群體中各隨機(jī)抽取一個樣，減去初篩時取過的2個群體的個體，共計(jì)8個個體，進(jìn)一步進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

上一步中篩選出的105對引物對隨機(jī)選取的8個個體擴(kuò)增結(jié)果見表2。

表2 復(fù)篩引物統(tǒng)計(jì)表

其中8個個體都能擴(kuò)增出清晰條帶的有49對引物，占復(fù)篩引物總數(shù)的46.67%。

復(fù)篩選中，引物可利用率達(dá)到7.88%。部分引物擴(kuò)增結(jié)果見圖2。

3 結(jié)論

圖2 8個樣品部分引物擴(kuò)增結(jié)果

從來自楊樹基因組的622對引物對與其同科不同屬的康定柳的擴(kuò)增結(jié)果來看，引物的擴(kuò)增成功率為7.88%。雖然概率比較低，但是最終得到的49對引物對所有代表性的樣品都可以穩(wěn)定地?cái)U(kuò)增出清晰的條帶，因而其引物可以在該物種的SSR分析中通用。

通用性引物的存在能夠有效地彌補(bǔ)物種分子標(biāo)記的不足，豐富標(biāo)記數(shù)量［10］。本研究在楊柳科中的康定柳這一川西高原特有的柳樹品種中證實(shí)了楊樹基因組SSR標(biāo)記在該樹種中的通用性。這對進(jìn)一步從分子水平上研究康定柳的遺傳多樣性、遺傳結(jié)構(gòu)、遺傳分化和構(gòu)建遺傳圖譜等具有重要的學(xué)術(shù)和應(yīng)用價值。

［1］ 馮毅，羅建勛，等.川西北地區(qū)康定柳天然群體表型多樣性研究［J］。西南林學(xué)院學(xué)報(bào)，2010，30(4):11 ～15.

［2］ Litt M，and Luty J A.A hypervariable microsatellite revealed byin vitroamplification of a dinucleotide repeat within the cardiac muscle actin gene，Am J Hum Genet，1989，44:397 ～401.

［3］ Powell W，Machray G C，and Provan J.Polymorphism revealed by simple sequence repeats.Trends in Plant Science，1996，1(7):215～222.

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［10］ 李宏偉，劉曙東，高麗鋒，等.小麥EST－SSRs的通用性研究［J］.植物遺傳資源學(xué)報(bào)，2003，4(3):252～255.