采用熒光探針測(cè)定五氯酚

姚英華，李娟秀，陳貝貝，蔡青云*

(1.湖南益陽(yáng)龍州中學(xué)，湖南益陽(yáng)431000）

(2.湖南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，化學(xué)生物傳感與計(jì)量學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南長(zhǎng)沙410082)

0 引言

五氯酚（pentachlorophenol，PCP，C6Cl5OH）是一易電離、難溶于水的氯代芳香族有機(jī)污染物，曾被廣泛用作殺菌劑、除草劑、殺蟲劑和木材防腐劑。通常條件下，五氯酚難氧化，難水解,難揮發(fā)。這也是我國(guó)紅壤資源退化的重要原因之一。另外，五氯酚有蓄積作用，在高有機(jī)質(zhì)含量的酸性土壤或沉積物上具有很高的吸附性，強(qiáng)烈地吸附在土壤中，可被植物吸收通過(guò)生物富集而進(jìn)入食物鏈，產(chǎn)生生物毒性。美國(guó)環(huán)境保護(hù)署（USEPA）把五氯酚劃分為B2（一種潛在的致癌物質(zhì)），在毒理學(xué)中屬中等毒性。五氯酚對(duì)水生生物的半致死量（LD 50）一般為 0.32～0.77 mg/L，對(duì)小鼠和大鼠的經(jīng)口半致死量（LD 50）分別為36～177 mg/kg和 25～175 mg/kg。

因此，發(fā)展能快速、靈敏地檢測(cè)五氯酚的方法就尤為迫切。目前，五氯酚的檢測(cè)主要是基于液相-質(zhì)譜或氣相-質(zhì)譜的聯(lián)用技術(shù)[1～3]。這些方法穩(wěn)定靈敏，但是耗時(shí)，并且需要復(fù)雜的前處理技術(shù)進(jìn)行有效的富集分離以適應(yīng)環(huán)境中痕量樣品的檢測(cè)?；谖迓确拥碾娀瘜W(xué)氧化而建立的電化學(xué)分析方法，由于其高氧化電位 （700～900 mV），使得其測(cè)定受到環(huán)境樣品中電活性雜質(zhì)的干擾[4～5]?；诿傅膫鞲蟹治隹捎糜谖迓确拥默F(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)，但是酶?jìng)鞲衅鞯臋z測(cè)限不能令人滿意[6]。免疫分析法可以用于大量樣品的篩查，對(duì)殺蟲劑的檢測(cè)限可達(dá)到1 μg/L水平。熒光分析具有很高的靈敏度。但對(duì)于惰性的五氯酚，必須進(jìn)行熒光標(biāo)記才能測(cè)定。

熒光素在藍(lán)光或紫外線照射下，發(fā)出綠色熒光。溶液的pH值不僅影響熒光素的吸收光譜，同時(shí)更顯著地影響其激發(fā)光譜和發(fā)射光譜[7]，在不同的酸度下，熒光素具有不同的最大吸收波長(zhǎng)、不同的最大激發(fā)波長(zhǎng)和熒光發(fā)射波長(zhǎng)。

該文基于熒光素的熒光光譜對(duì)pH的敏感性，提出了一種間接熒光法檢測(cè)五氯酚的方法。無(wú)需對(duì)五氯酚進(jìn)行熒光標(biāo)記，簡(jiǎn)化了檢測(cè)過(guò)程。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

試劑：熒光素和五氯酚，購(gòu)于J&K化學(xué)試劑有限公司(北京，中國(guó))；苯酚、一氯酚和二氯酚，購(gòu)于美國(guó)Aldrich-Sigma公司；磷酸二氫鉀，磷酸氫二鈉，氫氧化鈉和鹽酸購(gòu)于杰輝生物科技有限公司(長(zhǎng)沙，中國(guó))。實(shí)驗(yàn)中先配置濃度為0.001 mol/L五氯酚和0.001 mol/L的熒光素的DMF溶液，于4℃環(huán)境中儲(chǔ)存?zhèn)溆?，在?shí)驗(yàn)過(guò)程中用超純水稀釋至所需濃度。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中所用水由Millipore公司Synergy UV純水系統(tǒng)制備，電阻率值為18.2 MΩ·cm。實(shí)驗(yàn)中所有試劑均為分析純。

儀器：Delta 320型pH計(jì) (梅特勒-托利多儀器，上海有限公司)；超聲儀(上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司)；汞燈(500 W)用來(lái)提供紫外光，采用紅外濾光片濾去紅外光，以免溫度上升。光照計(jì)(Ophir,Israel）用于測(cè)量照射在反應(yīng)容器上的紫外光的光強(qiáng)；熒光分光光度計(jì)（PerkinElmer，LS45）。

1.2 熒光檢測(cè)五氯酚

在體積為4mL的透明石英小容器中，加入1mL一定濃度的五氯酚的水溶液 （由五氯酚的DMF溶液加入到水中稀釋而成），蓋上蓋子，防止受光照射而造成溶液揮發(fā)損失。光照前，充氮?dú)?5 min以除去溶液中的溶解氧，防止氧與五氯酚發(fā)生副反應(yīng)，干擾檢測(cè)。同時(shí)開啟汞燈預(yù)熱0.5 h，以得到穩(wěn)定的光照。將反應(yīng)容器與汞燈放置在同一水平線上，通過(guò)調(diào)整汞燈和盛有樣品的容器的距離，獲得不同強(qiáng)度的光照，光照強(qiáng)度由光照計(jì)測(cè)量。在汞燈和樣品間，緊靠汞燈處放置一塊紅外光濾光片。在光強(qiáng)為50 mW/cm2UV的汞燈下照射2.5 h后，向反應(yīng)液中加入一定濃度的熒光素 （由熒光素的DMF加入到水中稀釋而成），攪拌均勻。在400 nm激發(fā)下，測(cè)定460 nm到580 nm間的熒光光譜。狹縫寬度10 nm。以510 nm處的發(fā)射峰作為定量的標(biāo)準(zhǔn)峰。所有的試驗(yàn)均在室溫下進(jìn)行。

2 結(jié)果與討論

2.1 測(cè)定條件優(yōu)化

在紫外光光照下，五氯酚會(huì)被轉(zhuǎn)化為一些低毒性物質(zhì)，如CO2,H+,Cl-等物質(zhì)[8]，致使溶液的pH值降低。而熒光素是一種對(duì)溶液的pH值變化敏感的熒光試劑。當(dāng)溶液pH值改變時(shí)，熒光素的熒光強(qiáng)度以及發(fā)射光譜都會(huì)發(fā)生改變。所以通過(guò)監(jiān)測(cè)熒光素的熒光強(qiáng)度的變化，可以間接測(cè)定五氯酚。圖1為熒光素的熒光強(qiáng)度隨溶液pH值的變化。在pH＜6的酸性溶液里，熒光素的熒光強(qiáng)度對(duì)pH變化十分敏感。熒光素的熒光強(qiáng)度在中性和弱堿性時(shí)達(dá)到最大值，對(duì)pH的敏感性較低。

圖1 pH對(duì)熒光素?zé)晒鈴?qiáng)度的影響Fig.1 The effect of pH on the fluorescence intensity of fluorescein

可見測(cè)試溶液為酸性時(shí)，可獲得高靈敏度。而溶液的最終pH是在初始pH的基礎(chǔ)上取決于五氯酚的降解，即決定于溶液的初始pH和五氯酚的濃度。保持五氯酚的濃度為5.0×10-6mol/L，在溶液初始pH值為2～12的范圍里，在50 mW/cm2的汞燈 下照射 2.5 h后， 測(cè)定了加入 1.0×10-5mol/L的熒光素后熒光強(qiáng)度隨pH的變化（圖2）?？梢姛晒鈴?qiáng)度的相對(duì)變化即ΔI/I0（ΔI=I0-I，I0和I分別是溶液為光照前和光照后溶液的熒光強(qiáng)度）受溶液初始pH值影響很大，在pH4.75時(shí)，得到最大響應(yīng)。初始pH值不僅決定最終反應(yīng)液的pH,從而影響熒光素的熒光強(qiáng)度，而且影響五氯酚的光解效率。五氯酚是一種弱酸[9]，pKa為4.7，在堿性溶液中溶解度比酸性溶液中大，光解效率也相對(duì)要大些。兩廂作用的結(jié)果，在pH4.75時(shí)響應(yīng)靈敏度最大。

圖2 溶液的初始pH對(duì)熒光素檢測(cè)響應(yīng)的影響Fig.2 The influence of initial pH of the solution on the fluorescence intensity.The fluorescence spectra was collected after exposing a 5.0×10-6mol/L PCP solution with different pH to 50 mW/cm2UV for 2.5 h,then adding 1.0×10-5mol/L fluorescein

圖3 光照強(qiáng)度對(duì)響應(yīng)的影響Fig.3 The influence of light intensity on the fluorescence intensity.The fluorescence spectra was collected after exposing a pH4.75 solution containing 5.0 ×10-6mol/L PCP to UV with different intensity for 2.5 h,then adding 1.0×10-5 mol/L fluorescein

在固定溶液的初始pH后，溶液的最終pH取決于五氯酚的降解，即受光照時(shí)間和光強(qiáng)的影響。圖3顯示了熒光強(qiáng)度的相對(duì)變化（ΔI/I0）隨光強(qiáng)的增加而增大。當(dāng)光強(qiáng)從0增加到50 mW/cm2時(shí)，ΔI/I0從5%增加到32%。由于500 W的汞燈能提供的最大光強(qiáng)為50 mW/cm2，在實(shí)驗(yàn)中選擇了500 W汞燈的最大光強(qiáng)50 mW/cm2。圖4顯示了熒光強(qiáng)度的相對(duì)變化（ΔI/I0）隨光照時(shí)間的變化。 在光照時(shí)間為 0.5 到 2.5 h 的范圍內(nèi)，ΔI/I隨光照時(shí)間的增加而顯著增加，而在光照時(shí)間為2.5 到 3.0 h 的范圍內(nèi)，隨著時(shí)間的增加，ΔI/I0增加放緩了。為節(jié)省測(cè)定時(shí)間，選擇了2.5 h的光照時(shí)間。

圖4 光照時(shí)間對(duì)響應(yīng)的影響Fig.4 The influence of illumination time on the fluorescence intensity.The fluorescence spectra was collected after exposing a pH4.75 solution containing 5.0×10-6mol/L PCP to 50 mW/cm2UV for different time,then adding 1.0×10-5mol/L fluorescein

熒光素濃度也是影響熒光強(qiáng)度的一個(gè)因素。圖5顯示了熒光素的濃度對(duì)熒光強(qiáng)度的影響。當(dāng)熒光素的濃度從 1.0×10-7增加到 1.0×10-5mol/L，熒光強(qiáng)度的相對(duì)變化即ΔI/I0相應(yīng)地從5.26%增加到16.09%。這說(shuō)明熒光素的濃度越大，同等條件下其響應(yīng)就越大。由于受熒光素在水中溶解性的限制，選擇了熒光素在水中的最大溶解度1.0×10-5mol/L。

2.2 五氯酚測(cè)定

在以上所優(yōu)化的條件下，測(cè)定了熒光強(qiáng)度隨五氯酚濃度的變化。如圖6所示，隨著五氯酚濃度的增加，熒光素的熒光強(qiáng)度減小。熒光強(qiáng)度的相對(duì)變化ΔI/I0與五氯酚濃度的對(duì)數(shù)在5.0×10-4～5.0×10-9mol/L范圍成線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.99。 按三倍噪音計(jì)算所得的檢測(cè)限為 2.0×10-9mol/L。所得到的檢測(cè)限低于或與已見報(bào)道的數(shù)值相當(dāng)。比如：Codognoto等[5]采用鉆石電極電化學(xué)檢測(cè)五氯酚，檢測(cè)限為 5.5 μg/L(3.0×10-8mol/L)；Wu等[10]采用基于納米TiO2/十六烷基磷酸鹽的電化學(xué)傳感器檢測(cè)五氯酚，檢測(cè)限為1.0×10-8mol/L；Patricia Noguera等[11]采用酶聯(lián)免疫法檢測(cè)五氯酚，檢測(cè)限為0.1 ng/mL(5.6×10-11mol/L)。

圖5 熒光素濃度對(duì)響應(yīng)的影響Fig.5 The influence of fluorescein concentration on the fluorescence intensity.The Fluorescence spectra was collected after exposing a pH4.75 solution containing 5.0×10-6mol/L PCP to 50 mW/cm2UV for 2.5 h,then adding different concentrations of fluorescein

對(duì)該方法的重復(fù)性進(jìn)行了考察。濃度為5.0×10-7mol/L的五氯酚溶液，初始pH值4.75，置于光強(qiáng)為50 mW/cm2的汞燈下照射2.5 h。光照后，往溶液中加入濃度為1.0×10-5mol/L的熒光素，記錄熒光素的熒光強(qiáng)度的變化。相同的測(cè)試每天進(jìn)行一次，一共進(jìn)行10 d。對(duì)十次的測(cè)試結(jié)果進(jìn)行分析，得到相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為5.3%。由此可知，該方法的穩(wěn)定性和重復(fù)性較好。

2.3 干擾檢測(cè)

圖6 熒光強(qiáng)度與五氯酚濃度的關(guān)系五氯酚濃度分別為（mol/L）：(a)0,(b)5×10-9,(c)5×10-8,(d)5×10-7,(e)5×10-6,(f)5×10-5,(g)1.0×10-4,(h)5×10-4；插圖 為五氯酚的校正曲線Fig.6 Relationship between PCP concentration and fluorescence intensity.The PCP concentrations(mol/L)are:(a)0;(b)5×10-9;(c)5×10-8;(d)5×10-7;(e)5×10-6;(f)5×10-5;(g)1.0×10-4;(h)5×10-4.The insert is the calibration curve for PCP detection

為了考察該方法對(duì)五氯酚檢測(cè)的選擇性，選擇了五氯酚的類似物苯酚、一氯酚和二氯酚進(jìn)行了干擾分析。濃度為5.0×10-7mol/L的苯酚、一氯酚和二氯酚的磷酸鹽緩沖溶液 （pH為4.75），分別在50 mW/cm2汞燈光照2.5 h后，加入濃度為1.0×10-5mol/L的熒光素，記錄熒光素的熒光變化。結(jié)果如表1所示，響應(yīng)分別為苯酚：2.76%，一氯酚：7.79%，二氯酚：9.13%，五氯酚：35.84%。響應(yīng)隨苯環(huán)上氯取代數(shù)目增加而增加。對(duì)五氯酚有選擇性的響應(yīng)。主要原因是五氯酚本身比較容易光解，光解導(dǎo)致的pH值改變與氯的數(shù)目有關(guān)。氯數(shù)目越多，pH下降越大。苯酚最不易光解，響應(yīng)最小。結(jié)果表明：只有那些在光照過(guò)程中會(huì)改變?nèi)芤簆H值的物質(zhì)，才會(huì)對(duì)檢測(cè)產(chǎn)生干擾。

表1 間接熒光法檢測(cè)五氯酚的干擾分析Tab.1 The interferences to the indirect fluorescence analysis of PCP

2.4 水樣分析

最后考察了該方法對(duì)實(shí)際水樣分析的可行性。分別采集了自來(lái)水、岳麓山上的泉水和湘江的江水，用孔徑為0.22 μm的纖維素膜過(guò)濾后，取50mL水樣加熱蒸發(fā)濃縮到1mL，沒(méi)有檢出五氯酚。然后在上述水樣中加入濃度為5×10-5mol/L的五氯酚，測(cè)得回收率分別為：94.0%（自來(lái)水）,89.8%（泉水），和 119.5%（江水）。

3 小結(jié)

基于五氯酚紫外光照降解導(dǎo)致溶液pH改變的特點(diǎn)，通過(guò)指示劑熒光素的熒光變化來(lái)指示溶液pH值的變化，建立了對(duì)五氯酚的間接熒光分析法。該法的線性范圍 5.0×10-4～5.0×10-9mol/L，檢測(cè)限為 2.0×10-9mol/L（S/N=3）。該方法非常簡(jiǎn)單，亦無(wú)需復(fù)雜的熒光標(biāo)記反應(yīng)，檢測(cè)的靈敏度也得到了進(jìn)一步的提高。

[1]Sarrion M N,Santos F J,Galceran M T.Determination of chlorophenols by solid-phase microextraction and liquid chromatography with electrochemical detection[J].Journal of Chromatography A,2002,947(2):155～165.

[2]Cai Y Q,Cai Y E,Mou S F,et al.Multi-walled carbon nanotubes as a solid-phase extraction adsorbent for the determination of chlorophenols in environmental water samples[J].Journal of Chromatography A,2005,1081(2):245～247.

[3]Muna G W,Quaiserova′-Mocko V,Swain G M.Chlorinated Phenol Analysis Using Off-Line Solid-Phase Extraction and Capillary Electrophoresis Coupled with Amperometric Detection and a Boron-Doped Diamond Microelectrode[J].Analytical Chemistry,2005,77(22-23):6 542～6 548.

[4]Anandhakumar S,handrasekaran M,Noel M.Anodic oxidation of chlorophenols in micelles and microemulsions on glassy carbon electrode:the medium effect on electroanalysis and electrochemical detoxi fi cation[J].Journal of Applied Electrochemistry,2010,40:303～310.

[5]Codognoto L,Machado S A S,Avaca L A.Electrochemical Determination and Removal of Pentachlorophenol at Diamond Electrodes[J].Portugaliae Electrochimica Acta,2005,23:225～246.

[6]Saby C,Male K B,Luong J H T.A Combined Chemical and Electrochemical Approach Using Bis(trifluoroacetoxy)iodobenzene and Glucose Oxidase for the Detection of Chlorinated Phenols[J].Analytical Chemistry,1997,69(21):4 324～4 330.

[7]Wu M M,Llopis J,Adams S,et al.Organelle pH studies using targeted avidin and fluorescein-biotin[J].Chemisrey and Biology,2000,7(3):197～209.

[8]Barbeni M,Morello M,Pramauro E,et al.Sunlight photodegradation of 2,4,5-trichlorophenoxy-acetic acid and 2,4,5,trichlorophenol on TiO2Identification of intermediates and degradation pathway[J].Chemosphere,1987,16(6):1 165～1 179.

[9]Pecchi G,Reyes P,Sanhueza P, et al.Photocatalytic degradation of pentachlorophenol on TiO2sol-gel catalysts[J].Chemosphere,2001,43(2):141～146.

[10]Wu Y H.Nano-TiO2/dihexadecylphosphate based electrochemical sensor for sensitive determination of pentachlorophenol[J].Sensors and Actuators B,2009,137(1):180～184.

[11]Noguera P,Maquieira á,Puchades R,et al.Development of an enzyme-linked immunosorbent assay for pentachlorophenol[J].Analytica Chimica Acta,2002,460(2):279～288.