釀酒酵母乙醇發(fā)酵性能與脅迫耐性的相關性*

李莉莉 葉美莉 葉燕銳 林影

(華南理工大學生物科學與工程學院，廣東廣州510006)

釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是一類重要的工業(yè)微生物，長期應用于面包烘焙、酒精和飲料的生產中.近年來，研究發(fā)現生物燃料乙醇可作為石油基能源的替代品，因而釀酒酵母菌發(fā)酵生產乙醇的生理特性研究倍受關注［1-2］.

在乙醇的發(fā)酵過程中，酵母細胞會暴露在一系列的環(huán)境脅迫下，如高溫、高滲透壓、不斷積累的高濃度乙醇、底物饑餓和氧化脅迫等，這些不利的環(huán)境都會降低細胞活力和發(fā)酵效能［1］.目前，酵母細胞脅迫耐受能力是篩選乙醇高產菌株的一個重要評價標準，通過改善酵母脅迫耐受能力可明顯提高酵母發(fā)酵生產乙醇的能力［2］.在釀酒酵母菌種篩選的標準中，很多方面都與菌體的脅迫耐性相關，但對于酵母細胞耐性和發(fā)酵乙醇性能之間的相關性至今都未見系統(tǒng)的分析.

多變量數據分析在分類學中起著重要作用，其中線性判別式分析法(LDA)是一種多元變量的分類統(tǒng)計方法，可用于對測量結果的分組以及把新的測量結果分配至已經定義好的組類中［3］.基于LDA，多元變量的依賴性和關聯性的分析成為可能，同時能夠對數據進行簡化分析及對不同類別進行分類.LDA被廣泛應用于多元變量的數據分析中，如面部識別、腫瘤分類、芯片數據及食品科學的統(tǒng)計學分類中［4-5］.

文中應用高通量的微孔板液體培養(yǎng)方法來比較酵母適應不同脅迫條件的能力，為了更加客觀地描述細胞的脅迫耐性，引入一量化評價參數——生長抑制因子(Gi).文中考察了14株釀酒酵母在乙醇發(fā)酵過程中所遇到的各種脅迫條件及不同的脅迫強度，以期通過對14株釀酒酵母的統(tǒng)計學分析提出兩者具體的相關性，并且建立基于脅迫耐性預測發(fā)酵性能的統(tǒng)計學模型.

1 材料與方法

1.1 菌種

酵母菌株1-13號(No.1-No.13)均為不同的工業(yè)生產菌，來自不同的乙醇生產公司.釀酒酵母BY 4743(14 號菌株(No.14)，MATa/α his3Δ1/his3Δ1 leu2Δ0/leu2Δ0 LYS2/lys2Δ0 met15Δ0/MET15 ura3Δ0/ura3Δ0)購自美國Invitrogen公司.

1.2 酵母菌株26S rDNA的序列分析

通過分析14株酵母的D1/D2序列來探討它們之間的親緣關系.提取培養(yǎng)過夜的酵母的基因組作為PCR的模板［6］.LSU rRNA基因的差異結構域通過以下引物進行 PCR擴增:NL-1(5＇-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3＇)和 NL-4(5＇-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3＇).PCR 反應程序為:94℃預變性5min，循環(huán)開始，94℃變性1 min，53℃退火1min，72℃延伸 80 s，36 個循環(huán)之后，72℃延伸 10 min，最后冷至4℃.通過瓊脂糖凝膠電泳對PCR產物進行分析，來確認是否成功將目的基因從基因組中擴增出來.對獲得的PCR產物測序，將獲得的序列與已知數據庫中的相應結果進行比較.通過Clustal X軟件的鄰位連接(neighbor-joining)功能對其親緣關系進行分析.

1.3 酵母細胞的培養(yǎng)

酵母細胞首先在YPD培養(yǎng)基(酵母粉1%、蛋白胨2%、葡萄糖2%)中過夜培養(yǎng)，然后轉接入新鮮的YPD培養(yǎng)基中并置于自動讀數的恒溫酶標儀(美國熱電公司)中震蕩培養(yǎng)，細胞生長情況通過測定595 nm下的菌體濁度來監(jiān)測.

1.4 脅迫處理

對于酵母的脅迫耐性實驗，采用了 Carrasco、Aranda等［7-8］的研究方法，只對其進行了稍微的改動.在高溫脅迫實驗中，生長于30℃的細胞先被轉移至新鮮的YPD培養(yǎng)基中，然后于42℃下進行培養(yǎng).在山梨醇脅迫實驗中，細胞分別被轉移至0、1.0、1.5、2.0和 2.5 mol/L的山梨醇 YPD培養(yǎng)基中;在NaCl脅迫實驗中，細胞分別被轉移至0、0.5、1.0和1.5mol/L的NaCl YPD培養(yǎng)基中;在乙醇脅迫實驗中，細胞分別被轉移至0、10%、15% 和20%(體積分數)的乙醇YPD培養(yǎng)基中，然后于30℃下進行培養(yǎng)，其中脅迫開始的接種細胞數均約為2.5×105個/mL.脅迫耐性實驗都進行了3次獨立的生物學重復.

1.5 乙醇發(fā)酵

過夜培養(yǎng)的酵母細胞被轉接至新鮮的乙醇發(fā)酵培養(yǎng)基(酵母粉0.6%、蛋白胨1%、葡萄糖30%、(NH4)2SO40.5%、KH2PO41%、MgSO4·7H2O 0.05%和CaCl2·2H2O 0.015%)中，最初接種細胞數均約為2.5×105個/mL，在30℃下培養(yǎng)48h，每隔4h取樣對發(fā)酵性能進行分析.其中樣品的準備方法及乙醇和葡萄糖的檢測都參照文獻［9］中的實驗方法.發(fā)酵實驗進行3次生物學重復.

1.6 數據分析

用LDA對酵母細胞乙醇發(fā)酵性能與其脅迫耐性進行了相關性分析，同時利用交叉驗證法對其誤分類的可能性進行了評估.數據處理均采用SPSS軟件.

2 結果與討論

2.1 基于發(fā)酵性能對酵母菌株進行分類

將14株酵母菌株的26S rDNA D1/D2結構域擴增序列與GenBank數據庫中釀酒酵母核苷酸序列比對，其同源性高達98%.基于26S rDNA D1/D2的系統(tǒng)發(fā)育進化樹分析在分子水平上顯示，這些菌株均為釀酒酵母(S.cerevisiae)(見圖1).其中14號菌株S.cerevisiae BY4743為標準的陽性菌株.

為了分析這些菌株的發(fā)酵性能，在高糖濃度培養(yǎng)基(葡萄糖含量超過250 g/L)中進行了14株酵母菌株的乙醇發(fā)酵實驗，結果如表1所示，其中乙醇終產量由乙醇體積分數表示.相比于14號實驗室標準菌株，其它工業(yè)菌株均顯示出了較快的葡萄糖消耗速率和乙醇生產速率.根據葡萄糖消耗和乙醇生產能力對14株酵母菌株進行層次聚類分析發(fā)現，14株酵母菌株被分為3個發(fā)酵性能差異的組別(見圖2).結合表1的數據，發(fā)現第1組為發(fā)酵性能最好的一類，具有較高的乙醇終產量(大于12%，體積分數)和葡萄糖消耗速率;第3組是發(fā)酵性能最差的一類，具有較低的乙醇終產量(小于7%)和葡萄糖消耗速率;第2組菌株的發(fā)酵能力介于第1和第3組之間，此類菌株包括 No.1、No.10、No.4、No.8、No.11和No.7.

2.2 酵母脅迫耐性的分析

乙醇脅迫、滲透壓脅迫和高溫脅迫是乙醇發(fā)酵過程中，特別是高密度(VHG)發(fā)酵中最重要的3種脅迫類型［10-12］.對實驗室條件下細胞在各種不同環(huán)境脅迫下的耐性進行分析，結果發(fā)現，在山梨醇濃度為2.5mol/L、NaCl濃度為2.0mol/L、乙醇協(xié)迫實驗強度為15%和20%的條件下細胞生長受到嚴重抑制.細胞正常條件下的生長情況也被監(jiān)測，作為對照.No.6菌株顯示出了最差的生長能力，No.3、No.4、No.5、No.9、No.11、No.12、No.13 菌株長勢較好.

圖1 基于26S rDNA D1/D2的系統(tǒng)發(fā)育進化樹Fig.1 Phylogenetic trees based on 26S rDNA D1/D2 domain sequence

為了更好地評價菌株的脅迫耐性，引入生長抑制因子Gi(見表2).Gi定義為菌體在脅迫條件與在正常條件下菌體濁度的比例(菌體培養(yǎng)48h時).變量Gi不僅考慮到了菌體受脅迫環(huán)境的抑制作用，還考慮到了菌體正常條件下的生長情況，與僅研究脅迫條件下菌體的生長情況相比更為客觀.表2所示結果顯示，對于工業(yè)菌株來說，細胞耐性與發(fā)酵能力存在一定的正相關性，但對于實驗室標準菌株，此種關系不存在.

表1 釀酒酵母的乙醇產量和底物消耗情況1)Table 1 Ethanol yield and substrate consumption of S.cerevisiae

圖2 酵母發(fā)酵性能的層次聚類分析系統(tǒng)樹圖Fig.2 Dendrogram of hierarchical cluster of fermentation behavior of S.cerevisiae

2.3 多變量判別式分析

對各類脅迫條件下的數據進行全局性分析發(fā)現，發(fā)酵性能較差的菌株對不利環(huán)境會顯示出較強的敏感性(見表2)，可以建立一個預測發(fā)酵性能的標準以及對3種發(fā)酵性能差異類別的有效分類規(guī)則.LDA對個體樣本有一種先驗性的假定，如果一種特定的組別在數據空間中能夠很好地分類，那么LDA將會建立一種分類函數.該功能函數能夠將未知的樣本分配至已定義的特定組別中.在本研究中，可以建立基于細胞脅迫耐受能力、通過LDA的分類功能來預測發(fā)酵性能的模型.

通過SPSS軟件建立了數據矩陣(見表2)，其中矩陣包括14行(14株菌株)、9列(菌株編號、菌株對4種不同脅迫的抑制因子、菌株發(fā)酵性能的分類組別).在建立線性判別函數(LDF)時輸入所有自變量，然后SPSS會根據所輸入變量推測出兩個(菌株分類數3減1)功能函數(參數見表3).根據表3，最小的p值代表了最大的判別份量，函數Ⅰ對判別結果起著決定性的作用.另一種獲得函數判別力量的方式是通過散點圖(見圖3)，該圖把14株菌株根據兩個函數的判別數值通過二維平面圖展示出來.圖3中，中心數值代表了每個組中的典型類型.各個中心位點之間的關系再一次證明函數Ⅰ是決定性的判別函數.同時，進一步的判別分析對每個樣本在原來總樣本中的類別進行了驗證，并且給出了一個分類可能值，見表4，菌株被歸入先前根據發(fā)酵行為所分的類別中.

表2 各種脅迫條件下的菌體生長的受抑制情況1)Table 2 Inhibition of cell growth under various stress conditions

表3 SPSS建立的功能函數參數Table 3 Parameters of functions defined by SPSS program

圖3 酵母菌株發(fā)酵性能預測點值空間分配圖Fig.3 Predicted scores plot of yeast strains considering the fermentation behavior

表4 SPSS功能函數在菌株分組中的判別分析1)Table 4 Discriminant application of SPSS program functions to the group of strains

交叉性的驗證用于對數據的進一步檢驗分析.在該程序中，樣本被分為k份，只有一份不參與建立分類規(guī)則，然后用建立的分類函數對不參與的樣本進行分類，該過程重復k次，驗證結果的可能性為k次重復可行性的平均值.交叉驗證結果見表4，菌株No.5和菌株No.14分別被誤分在第3組和第1組.菌株No.14組別被誤分在意料之中，因為預測函數幾乎都是根據工業(yè)釀酒酵母建立起來的，而菌株No.14是實驗室標準菌株，該菌株的發(fā)酵性能與脅迫耐性的關系與工業(yè)菌株差異較大.造成該差異的原因可能是工業(yè)菌株在長久的進化過程中經歷了較為復雜的環(huán)境脅迫馴化歷程;另外，為了保證優(yōu)良的乙醇發(fā)酵性能，工業(yè)菌株需要具有較快、較好的環(huán)境響應能力.

以上結果顯示，對于各種脅迫條件，發(fā)酵能力與脅迫耐性是相關的，盡管這種相關性是不完全的.為了驗證這種相關性是否具有某種特定的相關模式，判別式分析法被用于對脅迫耐性和發(fā)酵能力的全部數據進行分析.像其他的預測方法一樣，該方法主要關注于預測變量與響應變量矩陣之間的關系，目的是對不同類別進行適當的分類，為未知個體分配至不同類別提供分類依據.此外，LDA能夠幫助解釋不同預測變量在組別分類中的具體作用.文中借助LDA，對酵母脅迫耐性和工業(yè)發(fā)酵過程的相關性有了更深入的了解，這種相關性可以在基于細胞耐性的條件下用于預測其他工業(yè)菌株的發(fā)酵性能.利用交叉驗證的方法發(fā)現85.7%的菌株是能夠被正確預測的，這就意味著對個體的分類并非偶然.

3 結語

文中考察了14株釀酒酵母在乙醇發(fā)酵過程中所遇到的各種脅迫條件及不同的脅迫強度，通過對14株釀酒酵母的統(tǒng)計學分析提出了兩者具體的相關性，并且建立了基于脅迫耐性預測發(fā)酵性能的統(tǒng)計學模型.

用于燃料乙醇發(fā)酵的理想菌株應該具有抵抗各種不同環(huán)境脅迫的能力，在實驗室條件下通過對細胞脅迫耐受能力的判定能夠對乙醇發(fā)酵菌株進行一個最初的篩選.用無需特殊技術的高通量的耐性評價試驗替代對酵母工業(yè)發(fā)酵能力的測定為整個菌株篩選提供了一種簡單快捷的方式，對酵母脅迫耐性的深度分析為理解和改善乙醇的發(fā)酵能力提供了依據.由于脅迫耐性和基因表達之間的相關性，不同脅迫條件下基因表達的差異對細胞抵抗不利環(huán)境也起到了很重要的作用.因此，可以通過對基因表達的研究獲得對細胞代謝行為更深入的認識，為菌株選育提供更有價值的線索.此外，Gi值被引入用于定量評價細胞的脅迫耐受能力.通過細胞脅迫耐性對發(fā)酵性能的正確預測說明用Gi來評價細胞脅迫耐性是科學且可行的.該方法不僅減少了耐性評價的主觀性和困惑性，而且可以通過高通量的試驗方式來實現.

［1］Gibson B R，Lawrence S J，Leclaire J P R，et al.Yeast responses to stresses associated with industrial brewery handling［J］.FEMS Microbiology Reviews，2007，31(5):535-569.

［2］葉燕銳，朱怡，李莉莉，等.耐熱酵母中海藻糖代謝途徑對熱脅迫的響應［J］.華南理工大學學報:自然科學版，2010，38(5):139-143.Ye Yan-rui，Zhu Yi，Li Li-li，et al.Response of metabolic pathway of trehalose in heat-resistant yeast Saccharomyces cerevisiae to heat stress［J］.Journal of South China University of Technology:Natural Science Edition，2010，38(5):139-143.

［3］Ni W D，Brown S D，Man R L.Wavelet orthogonal signal correction-based discriminant analysis［J］.Analytical Chemistry，2009，81(21):8962-8967.

［4］Tai F，Pan W.Incorporating prior knowledge of gene functional groups into regularized discriminant analysis of microarray data ［J］.Bioinformatics，2007，23(23):3170-3177.

［5］Huang D S，Zheng C H.Independent component analysisbased penalized discriminant method for tumor classification using gene expression data ［J］.Bioinformatics，2006，22(15):1855-1862.

［6］Liti G，Barton D B H，Louis E J.Sequence diversity，reproductive isolation and species concepts in Saccharomyces［J］.Genetics，2006，174(2):839-850.

［7］Carrasco P，Querol A，del Olmo M.Analysis of the stress resistance of commercial wine yeast strains［J］.Archives of Microbiology，2001，175(6):450-457.

［8］Aranda A，Querol A，del Olmo M.Correlation between acetaldehyde and ethanol resistance and expression of HSP genes in yeast strains isolated during the biological aging of sherry wines［J］.Archives of Microbiology，2002，177(4):304-312.

［9］Li L L，Ye Y R，Pan L，et al.The induction of trehalose and glycerol in Saccharomyces cerevisiae in response to various stresses［J］.Biochemical and Biophysical Research Communications，2009，387(4):778-783.

［10］Sree N K，Sridhar M，Suresh K，et al.Isolation of thermotolerant，osmotolerant，flocculating Saccharomyces cerevisiae for ethanol production［J］.Bioresource Technology，2000，72(1):43-46.

［11］Birch R M，Walker G M.Influence of magnesium ions on heat shock and ethanol stress responses of Saccharomyces cerevisiae［J］.Enzyme and Microbial Technology，2000，26(9/10):678-687.

［12］Querol A，Fernandez-Espinar M T，del Olmo M，et al.A-daptive evolution of wine yeast［J］.International Journal of Agricultural and Food Chemistry，2003，86(1/2):3-10.