利用體外受精－胚胎移植技術(shù)進(jìn)行ALK3基因敲除小鼠的保種鑒定

陳通克，管敏強(qiáng)，陳錫文

(溫州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心，浙江溫州325023)

基因敲除技術(shù)是20世紀(jì)80年代后半期應(yīng)用DNA同源重組原理發(fā)展起來的。胚胎干細(xì)胞(ES細(xì)胞)分離和體外培養(yǎng)的成功及哺乳動物細(xì)胞中同源重組的存在奠定了基因敲除的技術(shù)基礎(chǔ)和理論基礎(chǔ)［1］，但該模型的建立，需要投入大量的資金、人力和物力，又常常因一些人為或意外原因而丟失［2］。因此，建立一種快速、經(jīng)濟(jì)、可靠的基因敲除動物種質(zhì)保存方法尤為重要。為尋求一種適合于轉(zhuǎn)基因動物的較好保種技術(shù)，特進(jìn)行本研究，供參考。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 選用SPF級ALK3雌性小鼠及ALK3雄性小鼠作為體外受精供體，受體為SPF級ICR小鼠(合格證號為:SYXK(浙)2005－0061)。所有實(shí)驗(yàn)用小鼠均在清潔級動物房飼養(yǎng)和繁殖，鼠齡6－8周，溫度控制在(20±2)℃，自動光控(L∶D=12 h∶12 h，光照起始時(shí)間為 7:00 －19:00)［3］，飲用新鮮自來水，飼喂混合干飼料。

1.2 試劑及儀器 孕馬血清(PMSG寧波市激素制品廠生產(chǎn))、絨毛膜促性腺激素(HCG上海生物化學(xué)制藥廠生產(chǎn))、礦物油、透明脂酸酶、HTF培養(yǎng)液為Sigma生產(chǎn);DAP213 凍存液、1 mol/L DMSO、0.25 mol/L Sucrose由實(shí)驗(yàn)室自行配制。

1.3 超排卵 ALK3雌性小鼠2只，注射PMSG 7.5 IU/只，48 h 后腹腔注射 HCG 7.5 IU/只，與已結(jié)扎雄鼠 1∶1同籠交配［4］。

1.4 體外受精 ALK3雄性小鼠頸椎脫臼法處死，收集兩側(cè)附睪尾，用顯微剪剪破附睪尾，用拇指和食指輕輕擠壓，用解剖針挑出精子，放于HTF液滴中，將精子滴皿放于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(約1－2 h)。

ALK3雌性小鼠頸椎脫臼法處死，收集兩側(cè)輸卵管，放于濾紙上吸取表面水分及血絲，放于滴皿中的HTF旁，顯微鏡下觀察，用解剖針刺破膨大部，同時(shí)向外拉動(卵細(xì)胞從刺破口流出)，一直拉至HTF中，置于CO2培養(yǎng)箱中充分平衡。

取出經(jīng)培養(yǎng)后的精子滴皿和卵子滴皿，用移液槍吸取10 μL精子加入卵子液滴中，每個(gè)大滴均加入精子10 μL，再置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.5 胚胎收集 用自制移卵針挑選受精良好的2-cell至HTF液滴中，放入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.6 胚胎冷凍 將冷凍管(記錄標(biāo)簽、品系、數(shù)量、細(xì)胞名稱、時(shí)間等)、DAP213置于恒溫金屬浴中，預(yù)冷至0℃。滴皿中滴入5滴DMSO(分別均為200 μL)。

2-cell受精卵冷凍:首先將2-cell受精卵放入200 μL DMSO液滴中(待320枚2-cell沉至底部時(shí)即可分裝)，洗后移入100 μL DMSO液滴(80枚/滴)中，再用5 μL移液槍一次性將胚胎轉(zhuǎn)移至冷凍管中，在恒溫金屬浴中靜置5 min后加入45 μL DAP213，再在恒溫金屬浴中靜置5 min后放入液氮罐中。

1.7 胚胎復(fù)蘇［5］從液氮罐中取出冷凍管，倒棄液氮，空氣中放置30 s后用移液槍加入0.9 mL 0.25 M蔗糖溶液，輕輕吹打10～15次，將管內(nèi)液體移至滴皿中再用蔗糖清洗，將殘余2-cell移至滴皿中，在0.25 M蔗糖液滴旁滴入3滴KSOM，再用吸卵管從0.25 M蔗糖液滴中將2-cell移至KSOM中，洗3次后移至KSOM中置于CO2培養(yǎng)箱中靜置10 min后移植。

1.8 胚胎移植［6］2-cell胚胎的移植:用1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉假孕母鼠，酒精消毒后剪除背臀部毛，于髂骨和腎臟下方剪一縱切口，引出卵巢、輸卵管、子宮，在靠近輸卵管小彎處剪口，將移卵管從小口處插入輸卵管，將受精卵吹入壺腹部，片刻后拔出。將卵巢、輸卵管、子宮復(fù)位，最后縫合創(chuàng)口，青霉素消炎。做好移植記錄卡片，精心飼養(yǎng)，記錄產(chǎn)仔日期、產(chǎn)仔數(shù)量等。

1.9 PCR檢測 從仔鼠尾部抽提基因組DNA進(jìn)行PCR分析。

流程:在20體系中取1 μL DNA為模板，PCR檢測基因整合。

引物1:OVG 34:5'-TGA ATG AAC TGC AGG ACG AGG-3';

引物2:OVG 35:5'-AAG GTG AGA TGA CAG GAG ATC-3';

引物3:MHC-5:5'-ATG ACA GAC AGA TCC CTC CTA TCT CC-3';

引物4:Cre-3:5'-CTC ATC ACT CGT TGC ATC GAC-3'。

采用PCR擴(kuò)增儀進(jìn)行循環(huán)擴(kuò)增:預(yù)變性，94℃5 min;變性，94℃ 1 min;退火，60℃ 1 min;延伸，72℃ 1 min，共38個(gè)循環(huán)，最后延伸10 min。PCR鑒定結(jié)果詳見圖1。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 胚胎復(fù)蘇結(jié)果 2-cell冷凍保存前與經(jīng)胚胎冷凍、復(fù)蘇后觀察其生長狀況，發(fā)現(xiàn)經(jīng)復(fù)蘇后的2-cell除部分失去活力，兩者無顯著差異。冷凍前觀察到的2-cell如圖2所示。2.2 ALK3基因敲除小鼠胚胎冷凍復(fù)蘇結(jié)果 因ALK3基因敲除小鼠的純合子在11.5胚齡時(shí)死亡，因此出生時(shí)只有雜合子與基因缺失型小鼠［7］，凍存4管共計(jì)320枚，對4管進(jìn)行胚胎復(fù)蘇，獲得存活胚胎96枚，復(fù)蘇率達(dá)30%，對其中80枚胚胎進(jìn)行胚胎移植，產(chǎn)仔23只，平均產(chǎn)仔率為28.75%，對23對后代進(jìn)行PCR基因鑒定，結(jié)果顯示獲得雜合子11只，平均雜合子率為47.83%(詳見表1)。

表1 ALK3基因敲除小鼠胚胎冷凍復(fù)蘇結(jié)果

2.3 體外受精—胚胎移植后的產(chǎn)仔數(shù)與正常產(chǎn)仔數(shù)比較 ALK3基因敲除小鼠正常配種后生產(chǎn)小鼠數(shù)量為4～8只，經(jīng)體外受精—胚胎移植后的產(chǎn)仔數(shù)為3～7只，兩者差異不明顯。

3 小結(jié)與討論

胚胎冷凍保存是將動物的早期胚胎，采用特殊保護(hù)劑和降溫措施進(jìn)行冷凍，使其在－196℃的液氮中停止代謝或減弱到足夠小的程度，但又不失去升溫后恢復(fù)代謝的能力，從而能長期保存胚胎的一種生物技術(shù)。哺乳動物胚胎冷凍保存的研究始于20世紀(jì)50年代初期，Smith用甘油作防凍劑，將600枚一細(xì)胞兔胚胎冷凍，解凍后培養(yǎng)，僅發(fā)育6枚。Whittingham等(1972年)用緩慢冷凍-解凍法冷凍小鼠胚胎獲得成功。Rall等(1985)［8］建立了玻璃化冷凍胚胎的方法，隨后該技術(shù)得到了不斷的發(fā)展和完善，冷凍程序越來越簡單，解凍后的胚胎存活率越來越高。Kasai等(1990)［9］比較了各種抗凍保護(hù)劑對胚胎的化學(xué)毒性作用，發(fā)現(xiàn)乙酰胺毒性最大，其次為丙二醇、DMSO、丙三醇等，乙二醇毒性最低。由于乙二醇標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量較小，滲透速度快，從而進(jìn)一步降低了對胚胎的毒性作用。

本實(shí)驗(yàn)的胚胎冷凍方法主要基于ALK3基因敲除小鼠生殖能力低，而體外受精—胚胎移植(IVFET)對該小鼠進(jìn)行保種傳代的成功率有影響，因此采用傳統(tǒng)的胚胎冷凍方法，冷凍保護(hù)劑為DMSO、DAP213。DMSO因其良好的玻璃化性能和滲透能力及低毒性等特點(diǎn)成為首選試劑。

目前，ALK3基因敲除小鼠的冷凍保存雖取得了一定的成功，但移植后妊娠率和子代雜合子還較低，尋求一種適合于轉(zhuǎn)基因動物的保存技術(shù)仍有待進(jìn)一步研究。通過不斷改進(jìn)，相信超低溫冷凍保存技術(shù)將不僅適用于ALK3基因小鼠胚胎的保存，還將為其他基因敲除動物的保種提供依據(jù)。如果與其他胚胎工程技術(shù)相結(jié)合，還將有利于促進(jìn)畜牧業(yè)和生物工程的進(jìn)一步發(fā)展。

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［4］唐佐青，譚信，崔允文.不同光照制對小鼠超排卵的影響研究初報(bào)［J］.中國優(yōu)生與遺傳雜志，2003，11(1):70－73.

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［7］陳錫文，管敏強(qiáng)，陳通克，等.ALK3基因敲除小鼠的飼養(yǎng)繁殖及基因型鑒定［J］，黑龍江畜牧獸醫(yī)，2009.6:78－79.

［8］Rall WF，F(xiàn)ahy GM.Ice-free cryopreservation of mouse at-196 by vitrification［J］.Nature，1985，313:573 －575.

［9］Kasai M，Komi jH，Takakamo A，et al.A simple method for mouse embryo cryopreservation in a low toxicity vitrification solution，without appreciable loss of viability［J］.J Reprod Fert，1990，89:91 －97.