大孔吸附樹脂純化紫花地丁中綠原酸類成分的研究

劉 娟,羅家函,劉德江,高 原,馬珂佳

(佳木斯大學(xué)藥學(xué)院,黑龍江 佳木斯 154007)

紫花地丁(Viola yedoensis Makino)為堇菜科堇菜屬植物,又名光瓣堇菜、地丁草、獨(dú)行虎等,全草入藥,味微苦、辛,性寒 ,無毒,有清熱解毒,抗炎消腫的功能[1]。紫花地丁主要抗炎成分為其所含的綠原酸和黃酮等,綠原酸[2]異名咖啡鞣酸,是植物在有氧呼吸過程中經(jīng)莽草酸途徑產(chǎn)生的一種苯丙素類物質(zhì),為眾多藥材和中成藥的抗菌解毒、消炎利膽的主要有效成分。大孔吸附樹脂作為一種新型的吸附劑,鑒于其具有操作簡便、可再生、分離純化效果佳等許優(yōu)點(diǎn),近年來得到了廣泛的應(yīng)用[3]。本實(shí)驗(yàn)以紫花地丁中總綠原酸為指標(biāo),采用紫外-可見分光光度法,對8種大孔吸附樹脂進(jìn)行篩選,結(jié)果表明 H-107型大孔樹脂對紫花地丁中的綠原酸類成分選擇吸附性好,易于解析且純化效果優(yōu)良。

1 儀器與試藥

757型紫外-可見分光光度計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司)。大孔吸附樹脂:D-101(安徽三星樹脂有限公司);S-8、AB-8、 H-107、 H-103(南 開大學(xué) 化工廠 );HPD100、HPD400、HPD600(河北滄州寶恩吸附材料有限公司)。

紫花地丁藥材產(chǎn)于黑龍江佳木斯,經(jīng)佳木斯大學(xué)藥學(xué)院生藥教研室劉娟教授鑒定,符合《中華人民共和國藥典》2010年版一部標(biāo)準(zhǔn)。綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品由天津一方科技有限公司購得。乙醇為 GR級。

2 方法與結(jié)果

2.1 總綠原酸的測定

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備:精密稱取5.10mg于105℃干燥至恒重的綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品,加65%乙醇,配置成濃度為0.051mg/mL綠原酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備:精密稱取紫花地丁干燥粉末1.00g,置于錐形瓶中加20mL 65%的乙醇,200W超聲處理40min,過濾,濾液用65%的乙醇定容至100mL,備用。

2.1.3 紫外檢測波長的選擇:分別取標(biāo)準(zhǔn)品溶液與供試品溶液,在 200～ 800nm波長掃描。結(jié)果表明,對照品溶液與供試品溶液都在329nm波長處有最大吸收,所以選擇329nm作為檢測波長。

2.1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:分別精密吸取濃度為0.051mg/mL的綠 原 酸標(biāo) 準(zhǔn)品 溶 液 0.00、 2.00、 4.00、 6.00、8.00、10.00mL于 25mL容量瓶中,以 65%乙醇定容,于329nm處測定吸光度,對所測得數(shù)據(jù)取平均值,以綠原酸濃度為橫坐標(biāo) ,吸光度值為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得出回歸方程為 y=48.229x-0.0133(R2=0.9991)。

2.1.5 供試品含量測定:取供試品溶液,按紫外分光光度法操作,在329nm波長處測定吸光度,代入方程計(jì)算含量。

2.2 純化用供試品溶液的制備

取適量活性炭對“2.1.2”制備的供試品溶液進(jìn)行脫色,調(diào)節(jié)濃度為0.283mg/mL,備用。

2.3 樹脂預(yù)處理

各型號(hào)大孔樹脂分別以蒸餾水浸泡12h,飽和 NaCl溶液浸泡24h,4%NaOH溶液浸泡5h,去離子水洗至中性后,5%HCl溶液浸泡8h,再用去離子洗至中性,浸泡,待用。

2.4 大孔樹脂的篩選

2.4.1 靜態(tài)吸附:精密稱取等量的8種型號(hào)大孔樹脂置于50mL錐形瓶中,準(zhǔn)確量取相同濃度的樣品液20mL分別置入其中,將錐形瓶置于搖床上,室溫條件下 ,以100rpm的速度間隔性振搖12h,靜置12h,吸附達(dá)到平衡后,過濾,并用紫外分光光度計(jì)在329nm處測定濾液中殘留的綠原酸含量,并按下列公式計(jì)算各型號(hào)大孔樹脂的吸附率 E(%)。結(jié)果見表1。

2.4.2 靜態(tài)解析:向已經(jīng)吸附了紫花地丁綠原酸的8種型號(hào)大孔樹脂所在的錐形瓶中加入65%的乙醇20mL,將錐形瓶置于搖床上,室溫條件下,以100rpm的速度間隔性振搖12h,靜置 12h,解析完全后,過濾,再用一定量的 65%乙醇沖洗各型號(hào)大孔樹脂,合并濾液與沖洗液,并用紫外分光光度計(jì)在329nm處測定從大孔樹脂上解析出來的綠原酸含量,并按下列公式計(jì)算各型號(hào)大孔樹脂的解析率X(%)。結(jié)果見表1。

上述公式中:

Cα為吸附前紫花地丁溶液中所含綠原酸的濃度(mg/mL);Cβ為吸附后紫花地丁溶液中所含綠原酸的濃度(mg/mL);Cγ為解吸后紫花地丁溶液中所含綠原酸的濃度(mg/mL);Vα為吸附前紫花地丁溶液的體積 (mL);Vβ為吸附后紫花地丁溶液的體積(mL);Vγ為解吸后紫花地丁溶液的體積(mL)。

表1 8種大孔吸附樹吸附率與解析率測定結(jié)果

2.5 動(dòng)態(tài)吸附-洗脫試驗(yàn)

取適量的吸附率和解吸率都較高的 H-107型大孔吸樹脂,濕法上柱后,以樣品濃度為0.283mg/mL,調(diào)節(jié) pH=3.5,以3mL/min的速度上樣,以3.5倍柱體積65%乙醇,調(diào)節(jié)洗脫流速至3mL/min進(jìn)行洗脫,收集洗脫液,測定濾液中綠原酸含量,水浴蒸干后測定總固體質(zhì)量,并計(jì)算純化后所得紫花地丁綠原酸粗品含量 W(%),測得X=38.61%。

W(紫花地丁粗品含量)=CV/M×100%

式中:C為洗脫液中紫花地丁綠原酸的濃度;V為洗脫液的體積;M為洗脫液經(jīng)旋干后所得固形物的質(zhì)量。

3 討論

雖然 S-8型大孔樹脂在靜態(tài)吸附下的吸附率最高,但其解吸率較低。H-107型大孔樹脂在靜態(tài)吸附下具有較高的吸附率為74.71%,并且易于解吸,其解析率為 95.91%。這是因?yàn)榫G原酸是一種含有酚羥基的多酚類化合物,屬于極性分子,易與孔容和比表面積較大的 H-107型大孔樹脂形成氫鍵,因此吸附效果較好;又因其孔徑適中,因此解吸率較高。綜合考慮,選用 H-107型大孔樹脂最適合于紫花地丁中綠原酸類成分的純化,所得紫花地丁綠原酸純度較高。

[1] 任仁安.中藥鑒定學(xué) [M].上海:上?？萍汲霭嫔?1986,466

[2] 李定剛,張武崗.紫花地丁抗菌活性成分 [J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科版),2006,34(4):87-90

[3] Mi J Y,Song C Q.Advances of application of macroporous resin study of traditional Chinese herbs[J].Chin Tradit Pat Med(中成藥),2001,23(12):914-917