益生菌對(duì)大鼠潰瘍性結(jié)腸炎作用的實(shí)驗(yàn)研究

薛 宇,顏 玉,蒲 田,張高揚(yáng),喬 坤,王美巍

(1.佳木斯大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院,黑龍江 佳木斯 154003;2.佳木斯大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化一科,黑龍江 佳木斯 154003)

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis,UC)是一種慢性非特異性腸道炎癥性疾病,其病因和發(fā)病機(jī)制仍不清楚,目前大多數(shù)研究認(rèn)為細(xì)胞因子與 UC的發(fā)病有密切關(guān)系。細(xì)胞因子的表達(dá),可作為檢測(cè) UC疾病嚴(yán)重程度的指標(biāo)[1]。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn),核因子-kB(N F- kB)通過(guò)調(diào)控細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄和釋放而調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的分泌,促進(jìn)炎癥反應(yīng),導(dǎo)致黏膜損傷發(fā)揮著重要作用[2]。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TNF-β)在多種組織細(xì)胞的增殖分化、間質(zhì)形成、組織損傷修復(fù)、骨質(zhì)再生、胚胎發(fā)生中起著關(guān)鍵作用[3]。同時(shí)研究證實(shí) UC的發(fā)生與腸道菌群關(guān)系密切。近年來(lái),有人嘗試應(yīng)用益生菌制劑作為治療 UC的藥物,其作用己經(jīng)得到有效的肯定[4]。本研究采用益生菌制劑美常安治療 UC大鼠,檢測(cè)細(xì)胞因子 NF- kB和 TGF-β的變化,旨在從細(xì)胞水平上探討益生菌對(duì) UC的療效,以期能夠?yàn)閼?yīng)用益生菌制劑治療 UC提供證據(jù),從而為臨床提供一個(gè)新的治療 UC的方法。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物模型的制備

選用佳木斯大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供的健康 Wistar大鼠30只,雌雄各半,體重270～ 330g,將大鼠隨機(jī)分為正常組,模型組 ,美沙拉嗪組,益生菌組,聯(lián)合用藥組 ,每組各6只。將30只大鼠禁食不禁水48h,用乙醚淺麻醉后放置于固定器中,正常對(duì)照組大鼠以2mL生理鹽水經(jīng)導(dǎo)管導(dǎo)入結(jié)腸,其余四組用5%乙酸1.0mL緩慢注入肛門內(nèi)約8cm處,將大鼠倒置 10s后用4mL生理鹽水沖洗。3d后,正常對(duì)照組和模型組每日給2mL生理鹽水灌胃;SASP組以 0.5g/kg體重 SASP溶液2.5mL每日灌胃一次;益生菌組以12.5g/kg體重美常安溶液2.5mL每日灌胃一次;聯(lián)合用藥組上午8時(shí)以0.5g/kg體重 SASP溶液灌胃一次和下午4時(shí)以12.5g/kg體重美常安溶液每日灌胃一次,7d后處死,剖開腹部,取結(jié)腸組織,分別用蒸餾水和生理鹽水沖洗,沿腸系膜剪開,取潰瘍組織至于10%甲醛中固定。

1.2 病理學(xué)免疫組化學(xué)檢測(cè)

將標(biāo)本常規(guī)梯度酒精脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、切片厚度5 μm,粘于多聚賴氨酸處理后的切片上,染色步驟嚴(yán)格按說(shuō)明書進(jìn)行。陰性對(duì)照切片不加一抗,用0.1mmol/LPBS代替,不出現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng),說(shuō)明一抗特異性強(qiáng)。在40×10倍光鏡下隨機(jī)選擇 6個(gè)視野,做免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)計(jì)數(shù),實(shí)驗(yàn)中使用兔抗鼠 NF-kB和 TGF-β均購(gòu)自北京博奧森生物有限公司。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 一般狀況

正常組大鼠活動(dòng)如常,反應(yīng)機(jī)警,毛發(fā)有光澤,飲食量正常,體重增加;模型組大鼠精神萎靡,毛發(fā)無(wú)光澤,飲食量減少,體重減輕,出現(xiàn)稀便、血便。各治療組大鼠的一般狀況隨給藥時(shí)間延長(zhǎng)逐漸好轉(zhuǎn),飲食量增加,體重增加,血便消失,聯(lián)合用藥組一般狀況改善明顯。

2.2 結(jié)腸黏膜肉眼觀察及病理切片檢查

模型組結(jié)腸黏膜充血水腫,有多個(gè)大小不一的潰瘍形成。益生菌組、SASP治療組和聯(lián)合治療組腸壁僅見潰瘍愈合后殘留的痕跡。病理切片顯示模型組有潰瘍形成,腸黏膜上皮細(xì)胞壞死脫落,黏膜下淋巴細(xì)胞增生并有淋巴濾泡形成,中性粒細(xì)胞浸潤(rùn),隱窩炎和隱窩膿腫;SASP和益生菌治療組顯示無(wú)潰瘍,黏膜固有層內(nèi)有少數(shù)淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)、個(gè)別腺腔有灶性上皮壞死;聯(lián)合用藥組僅見黏膜上皮內(nèi)灶性淋巴細(xì)胞浸潤(rùn),其它無(wú)異常發(fā)現(xiàn)。

2.3 免疫組化技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞因子測(cè)定

見表1。

表1 各組大鼠 N F-к B及 TGF-β的變化 ±s,n=6)

表1 各組大鼠 N F-к B及 TGF-β的變化 ±s,n=6)

注:與正常組比較△P＜0.05;與模型組比較☆P＜0.05。

組別 N F-к B TGF-β正常組 9.39± 2.72220.4± 7.276模型組 44.16± 13.134△ 69.4± 19.329△美沙拉嗪組 19.22± 3.981△☆ 34.5±11.412△☆益生菌組 26.92± 8.309△☆ 38.5±12.436△☆聯(lián)合治療組 10.21±3.271☆ 25.4±8.079☆

從表1可以看出:①SASP組、益生菌組和聯(lián)合用藥組N F-к B、TGF-β表達(dá)均低于模型組,有顯著性差異(P＜0.05),說(shuō)明常規(guī)藥物、益生菌及聯(lián)合用藥均可有效降低結(jié)腸粘膜 NF-к B、TGF-β表達(dá)。②聯(lián)合用藥組與益生菌組和 SASP組有顯著差異 (P＜0.05),而與正常對(duì)照組無(wú)顯著差異 (P＞ 0.05),說(shuō)明聯(lián)合用藥治療 UC比單獨(dú)用藥效果更佳。③益生菌組和 SASP組 N F-кB、TGF-β表達(dá)無(wú)顯著差異 (P＞ 0.05),說(shuō)明效果相當(dāng)。

3 討論

目前對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)病機(jī)制普遍認(rèn)為主要由免疫反應(yīng)介導(dǎo),并與遺傳、感染、環(huán)境因素等密切相關(guān)的慢性炎性疾病,其中細(xì)胞因子在 UC的發(fā)病中起著重要的作用。研究顯示,N F-кB調(diào)控細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄和釋放,并且細(xì)胞因子分泌的增加有關(guān),從而引起炎癥反應(yīng)。TGF-β有促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)合成的作用,激活纖連蛋白、膠原蛋白Ⅰ、Ⅱ、V、Ⅵ等的合成與分泌;直接促進(jìn)成纖維細(xì)胞合成細(xì)胞外基質(zhì),并對(duì)新合成的細(xì)胞外基質(zhì)的降解有顯著的抑制作用。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn) UC大鼠 NF-кB及 TGF-β表達(dá)明顯增加,與正常組相比差異有顯著性,表明了 N F-к B與腸道炎癥的產(chǎn)生有關(guān),是一種調(diào)節(jié)各種炎癥細(xì)胞因子、趨化因子的轉(zhuǎn)錄因子。在UC的研究過(guò)程中,近年來(lái)人們開始注意到腸腔內(nèi)細(xì)菌在發(fā)病中的重要作用。UC病人的腸黏膜細(xì)菌的屏障功能是紊亂的。許多學(xué)者開始重視腸道共生菌群的變化,以求在細(xì)菌方面找到 UC的發(fā)病機(jī)制,并且設(shè)想用益生菌及其產(chǎn)物來(lái)治療UC。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí),應(yīng)用益生菌美常安和 SASP后,可有效改善癥狀,減輕腸黏膜的病理?yè)p害,腸黏膜 NF-кB及TGF-β表達(dá)明顯減少,但細(xì)胞因子表達(dá)與正常對(duì)照組尚有顯著差異,而經(jīng)聯(lián)合用藥治療后,更顯著改善大鼠腹瀉癥狀,減輕腸黏膜病理?yè)p害,腸黏膜 N F-кB及 TGF-β表達(dá)明顯減少,與對(duì)照組無(wú)顯著差異,說(shuō)明益生菌、SASP對(duì)治療 UC確實(shí)有效,而聯(lián)合用藥效果更佳。益生菌的作用機(jī)制有以下幾種可能:(1)益生菌作用后產(chǎn)生的低分子量多肽具有促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖,而后者能恢復(fù)吞噬細(xì)胞的功能,從而殺滅和消除已侵入的微生物。(2)益生菌與腸黏膜免疫系統(tǒng)相互協(xié)作,維持對(duì)炎癥的生理性控制和激活腸道相關(guān)性淋巴組織。(3)益生菌可以增強(qiáng)上皮緊密連接以阻止致病菌侵入。益生菌可以通過(guò)與致病菌競(jìng)爭(zhēng)腸上皮微絨毛上的脂質(zhì)和蛋白質(zhì)上的相同復(fù)合糖(glycoconjugate)受體來(lái)達(dá)到阻止致病菌的定植。(4)益生菌通過(guò)促進(jìn)損傷上皮的修復(fù),防止致病菌在腸道上皮細(xì)胞間的移位。

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