箬葉多糖對體外培養(yǎng)的宮頸癌細(xì)胞的抑制作用

劉 超 靳 祎 王恩軍 盧雪崢 李雙成

1.河北省保定市第一中心醫(yī)院眼一科，河北 保定 071000;2.河北大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河北 保定 071000;3.河北省保定市第一中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河北 保定 071000;4.河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河北 石家莊 050017

箬葉是禾本科植物箬竹 (Indocalamus tesselatus)的葉。它味甘性寒，有清熱止血、解毒消腫之效，可以治療吐血、下血、小便不利、喉痺、癰腫等病癥［1、2］?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)箬葉中含有多種維生素、氨基酸、茶多酚、礦物質(zhì)、多糖、黃酮類物質(zhì)和各種芳香成分［3］，其中箬葉及箬竹根所含的多糖，對體內(nèi)實驗動物腫瘤具有抑制作用［4－6］。本試驗采用人宮頸癌Hela細(xì)胞作為試驗?zāi)Ｐ?，研究箬葉多糖對體外培養(yǎng)的宮頸癌細(xì)胞的抑制作用，為宮頸癌的臨床治療提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料 ①箬葉多糖:由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)院提供，采用苯酚－硫酸法測定多糖含量為49.08%。試驗前制成500 mg/mL的溶液，過濾除菌4℃保存，原生藥購自江西九江市;②人宮頸癌細(xì)胞株Hela:由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)院提供。

1.2 儀器和試劑 CO2培養(yǎng)箱:美國SHELDON公司;凈化工作臺:蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;酶標(biāo)儀:鄭州博塞生物工程公司;倒置顯微鏡:奧林巴斯CKX41;48孔及96孔培養(yǎng)板:美國Costar公司;胎牛血清:天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司;DMEM培養(yǎng)液和胰蛋白酶:GIBCO公司;順鉑:齊魯制藥有限公司;四甲基偶氮唑鹽 (MTT)、二甲基亞砜 (DMSO):美國Sigma公司。

1.3 方法

1.3.1 Hela細(xì)胞的體外培養(yǎng) 將Hela細(xì)胞貼壁生長于DMEM完全培養(yǎng)液體系 (含10% 胎牛血清，青霉素和鏈霉素各100 U/mL)，置于37℃、飽和濕度、5%CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞長至對數(shù)生長期時用DMEM完全培養(yǎng)基將細(xì)胞濃度調(diào)整為2×105個/mL的細(xì)胞懸液待用。

1.3.2 MTT法檢測箬葉多糖對Hela細(xì)胞增殖的抑制作用按2×105個/mL的細(xì)胞密度將Hela細(xì)胞接種到96孔培養(yǎng)板中，終體積為每孔200 μL。試驗分三組，陰性對照組加入生理鹽水，陽性對照組加入順鉑 (濃度為20 μg/mL)，實驗組加入不同濃度的箬葉多糖，終濃度分別為25 mg/mL，50 mg/mL，100 mg/mL，200 mg/mL，并設(shè) 4個平行孔，分別培養(yǎng)24h、48h和72h后加入MTT液 (5 μg/μL)20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4h，棄上清液，加入DMSO每孔150 μL，震蕩15 min，測定吸光度值 (A值)，測定波長λ=570 nm，參考波長 λ=630 nm，計算抑制率 (Grow inhibitory rate，GIR):

抑制率 (%)=(對照組A值－實驗組A值)/對照組A值×100%，并計算箬葉多糖對Hela細(xì)胞半抑制率(IC50)。

1.3.3 形態(tài)學(xué)觀察 取對數(shù)生長期的Hela細(xì)胞接種于48孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，培養(yǎng)24 h，實驗組加入100 mg/mL的箬葉多糖，對照組加入生理鹽水，培養(yǎng)48 h后在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)變化。

1.3.4 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用The SAS system 6.12統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。兩組間數(shù)據(jù)用t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 箬葉多糖對體外培養(yǎng)的Hela細(xì)胞的抑制作用

2.1.1 箬葉多糖對Hela細(xì)胞抑制作用的量效關(guān)系 Hela細(xì)胞經(jīng)不同濃度的箬葉多糖作用48 h后，細(xì)胞抑制作用明顯，且隨著藥物濃度的升高，抑制率逐漸增強，劑量效應(yīng)關(guān)系顯著，與陰性對照組比較差異顯著 (P﹤0.05)(表1)。

表1 不同濃度的箬葉多糖對Hela細(xì)胞的抑制作用n=4，

表1 不同濃度的箬葉多糖對Hela細(xì)胞的抑制作用n=4，

注:與對照組相比，#P﹤0.05，▲P﹤0.01

2.1.2 箬葉多糖對Hela細(xì)胞抑制作用的時效關(guān)系 4種不同濃度的箬葉多糖作用于Hela細(xì)胞24、48、72 h，Hela細(xì)胞的受抑制程度與時間有關(guān)，隨著作用時間的延長，抑制作用明顯增強，具有良好的時效關(guān)系 (表2)。

表2 箬葉多糖不同作用時間對Hela細(xì)胞的抑制率n=4，

表2 箬葉多糖不同作用時間對Hela細(xì)胞的抑制率n=4，

2.1.3 箬葉多糖對Hela細(xì)胞抑制作用的IC50

通過MTT法作出的Hela細(xì)胞生長曲線得出箬葉多糖抑制細(xì)胞生長50%時的濃度為157 mg/mL(48h)。

2.2 形態(tài)學(xué)觀察 對照組宮頸癌Hela細(xì)胞呈扁平的不規(guī)則長梭形或多角形，核圓形，位于中央，排列無方向性，細(xì)胞邊緣清楚，培養(yǎng)基內(nèi)懸浮的細(xì)胞和碎片少;實驗組箬葉多糖作用Hela細(xì)胞，胞膜起皺，數(shù)量減少，細(xì)胞呈圓形，與周圍細(xì)胞脫離，培養(yǎng)基內(nèi)懸浮的細(xì)胞和碎片多。

3 討論

宮頸癌在女性惡性腫瘤中，發(fā)病率僅次于乳腺癌而位居第二。它占據(jù)了生殖器官癌癥的一半以上，更是生育期和更年期這兩個階段發(fā)病率最高的疾病。臨床上治療宮頸癌主要采取手術(shù)、放化療等綜合治療，但它們所帶來的并發(fā)癥也很多，而且化療藥物本身費用昂貴、久易耐藥、毒性較大。而傳統(tǒng)中醫(yī)藥積累了大量治療婦科疾病的經(jīng)驗與驗方，辨證論治對減少宮頸癌化療和放療的副作用均有較好的輔助作用，這對鞏固和加強宮頸癌的治療效果，延長患者生命和保證生存質(zhì)量是具有積極意義的［7］。

箬葉，俗稱竹箬、箬皮，即箬竹的葉子，別名遼葉、茶篰若葉，為禾本科植物箬竹的葉。箬竹是一種個子較矮的竹子，分布于東南亞一帶，我國長江流域均有栽種，它葉片巨大，又有特殊芳香，用來裹粽最為適宜。箬葉除用于裹粽外，還有藥用價值。上世紀(jì)80年代，德國和日本的醫(yī)學(xué)家發(fā)現(xiàn)，中國包粽子的箬葉有抗癌作用。報告說，箬葉除一般營養(yǎng)成分外，還含有一種箬竹多糖，具有殺菌、防腐、抗癌的功用，日本已經(jīng)用箬竹葉中提取的多糖來治療喉、舌、胃、食管、鼻咽、腹腔等癌癥，療效顯著。

本試驗使用人宮頸癌Hela細(xì)胞作為代表細(xì)胞株，采用MTT法觀察不同濃度的箬葉多糖對人宮頸癌細(xì)胞的作用。結(jié)果表明:不同濃度的箬葉多糖作用細(xì)胞后，對體外培養(yǎng)的Hela細(xì)胞有較強的抑制作用;且抑制程度與箬葉多糖的濃度和作用時間有關(guān)。濃度越高抑制作用越強，作用時間越長抑制效果越明顯，顯示典型的量效關(guān)系和時效關(guān)系，對Hela細(xì)胞的IC50為157 mg/mL。另外細(xì)胞毒性的形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果顯示箬葉多糖作用于細(xì)胞后，可看到較為典型的細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化，說明箬葉多糖對體外培養(yǎng)的Hela細(xì)胞有明顯的抑制作用，這為今后進(jìn)一步研究箬葉的抗腫瘤作用機制提供了試驗依據(jù)。

［1］艾文勝，湯騰方，楊建勝等.箬竹利用現(xiàn)狀及葉用園營建技術(shù)［J］.林業(yè)科技開發(fā)，2006，20(1):69－71.

［2］季宇彬.中藥多糖的化學(xué)與藥理［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，2005，226－230.

［3］李水芳，李姣娟.箬葉化學(xué)成分的比較研究［J］.食品研究與開發(fā)，2008，29(12):7－10.

［4］陳春英，丁玉強，E.A.ELMAHADI等.堿液提取箬葉多糖的純化及其結(jié)構(gòu)性質(zhì)的研究［J］.生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，1999，26(1):51－55.

［5］蔣巖，陳春英，裴麗健等.硫酸酯化箬葉多糖抗HIV－1機制的初步研究［J］.中華實驗和臨床病毒學(xué)雜志，2000，14(1):56－59.

［6］張賽丹，方巖雄，陳敏敏等.幾種傳統(tǒng)中藥中多糖的提取及抗腫瘤活性研究［J］.中藥材，2007，30(2):179－182.

［7］關(guān)素潔.宮頸癌的發(fā)病機制及中醫(yī)藥治療研究進(jìn)展［J］.中醫(yī)藥導(dǎo)報，2007，13(2):95－97.