拉米夫定對(duì)慢性乙型肝炎患者CD28表達(dá)的影響

涂遠(yuǎn)航，馬 勇，谷 旻

1)解放軍第123醫(yī)院肝病中心 蚌埠233015 2)解放軍第123醫(yī)院檢驗(yàn)科蚌埠233015

慢性乙型肝炎(CHB)的治療，抗病毒是關(guān)鍵。但CHB患者對(duì)抗病毒藥物的反應(yīng)差異較大。目前普遍認(rèn)為，T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫對(duì)乙型肝炎病毒(HBV)的清除起關(guān)鍵作用，T淋巴細(xì)胞表面協(xié)同刺激分子及其配體的正常表達(dá)是其活化和發(fā)揮功能的關(guān)鍵因素。目前關(guān)于CD28在乙型肝炎免疫耐受中的作用研究［1-2］較多，但CD28的表達(dá)與抗病毒療效之間的關(guān)系，國(guó)內(nèi)外鮮見(jiàn)報(bào)道。該研究檢測(cè)了CHB患者外周血T淋巴細(xì)胞CD28的表達(dá)，以分析其表達(dá)與抗病毒療效的關(guān)系。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 42例CHB患者均為解放軍第123醫(yī)院肝病中心2006年5月至2010年6月收治的住院患者，男36例，女6例;年齡15～54(30±10)歲。所有病例均符合文獻(xiàn)［3］的診斷標(biāo)準(zhǔn)。所有病例均排除HBV相關(guān)性疾病，合并甲、丙、丁、戊型肝炎病毒感染者及自身免疫相關(guān)疾病者。入選前均未接受過(guò)抗病毒治療和免疫治療。入選后均給予拉米夫定片100 mg口服，1次/d，療程3 a，治療期間定期監(jiān)測(cè)ALT、AST、膽紅素、白蛋白，以及病毒學(xué)標(biāo)志包括HBeAg、抗-HBe和HBV DNA等。根據(jù)治療后的應(yīng)答情況，分為完全應(yīng)答組、部分應(yīng)答組和無(wú)應(yīng)答組［3］。完全應(yīng)答組(n=11):HBeAg陽(yáng)性 CHB患者，治療后 ALT恢復(fù)正常，HBV DNA檢測(cè)不出(PCR法)和HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換;HBeAg陰性CHB患者，治療后ALT恢復(fù)正常，HBV DNA檢測(cè)不出(PCR法)。部分應(yīng)答組(n=21):介于完全應(yīng)答與無(wú)應(yīng)答之間。如HBeAg陽(yáng)性CHB患者，治療后ALT恢復(fù)正常，HBV DNA＜105拷貝/mL，但無(wú)HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換。無(wú)應(yīng)答組(n=10):未達(dá)到以上應(yīng)答者。

1.2 CD28表達(dá)情況的檢測(cè) ①外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)的分離:在被檢測(cè)者抗凝血中加入等體積Hank’s液，混合均勻。取一個(gè)10 mL無(wú)菌離心管，加入4 mL Ficoll液于離心管底部，用移液管將稀釋的血液緩慢加入到Ficoll液上層，此時(shí)試管內(nèi)的液體分為2層，上層為稀釋的血液，下層為Ficoll液。靜置10 min后1 700 r/min離心20 min。離心后，上清液分為5層，分別為血漿層、PBMC層、Ficoll液層、粒細(xì)胞層和紅細(xì)胞層。棄去血漿，將PBMC層轉(zhuǎn)移到另外一個(gè)無(wú)菌試管中，用Hank’s液洗滌，1 700 r/min離心，棄上清，共洗滌3次，獲得PBMC。②外周血淋巴細(xì)胞CD4、CD8、CD28的檢測(cè):采用熒光素二抗體標(biāo)記法結(jié)合流式細(xì)胞儀檢測(cè)，取專(zhuān)用試管依次加入 PBMC(濃度1×106mL－1)、CD4/CD28、CD8/CD28單克隆抗體各20 μL，混勻置暗處室溫放置30 min，每管再加 PBS 0.5 mL混勻置4℃待測(cè)，流式細(xì)胞儀測(cè)定分析采用BD公司GENQUES軟件(每次獲取10 000個(gè)細(xì)胞統(tǒng)計(jì)結(jié)果)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 11.5進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用單因素方差分析比較各組治療前后CD4+CD28+和CD8+CD28+變化量的差異，兩兩比較采用 LSD-t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn) α =0.05。

2 結(jié)果

3組患者抗病毒治療前后CD28表達(dá)情況比較見(jiàn)表1。

表1 3組患者抗病毒治療前后CD28表達(dá)情況比較 %

3 討論

拉米夫定是目前臨床抗病毒治療的一線藥物之一，它能顯著抑制HBV復(fù)制，改善肝臟生化功能和肝組織學(xué)病變。Yuen等［4］的研究結(jié)果表明，CHB患者長(zhǎng)期服用拉米夫定治療可明顯降低肝硬化和肝癌發(fā)生率。雖然多數(shù)CHB患者對(duì)拉米夫定反應(yīng)良好，但仍有部分患者經(jīng)拉米夫定治療后應(yīng)答不佳，甚至無(wú)應(yīng)答。因此，如何提高CHB患者對(duì)抗病毒治療的應(yīng)答率，是目前臨床醫(yī)生關(guān)注的熱點(diǎn)問(wèn)題。

目前已經(jīng)明確，T淋巴細(xì)胞在清除病毒的過(guò)程中作用十分關(guān)鍵，靜止 T細(xì)胞必須接受抗原提呈細(xì)胞提呈的雙信號(hào)才能活化，第一信號(hào)是抗原特異性的;第二信號(hào)是由T細(xì)胞上的CD28與抗原提呈細(xì)胞上的B7分子結(jié)合而提供的。只有兩個(gè)信號(hào)同時(shí)存在時(shí)，T細(xì)胞開(kāi)始增殖并分泌相應(yīng)細(xì)胞因子。若沒(méi)有CD28提供第二信號(hào)，T細(xì)胞識(shí)別抗原后不能充分活化并表現(xiàn)效應(yīng)功能，則導(dǎo)致 T細(xì)胞無(wú)能。Hara等［5］研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)同時(shí)阻斷 CD28和誘導(dǎo)性協(xié)同刺激分子，可使淋巴細(xì)胞活性失能;Fan等［6］研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)阻斷 CD28/B7可抑制 T細(xì)胞活化，并能誘導(dǎo)免疫耐受。CHB患者T淋巴細(xì)胞表面CD28分子數(shù)量減少，可能是病毒難以清除的原因之一［7-8］。作者觀察了CHB患者服用拉米夫定抗病毒治療前后細(xì)胞表面CD28的表達(dá)情況，結(jié)果顯示對(duì)拉米夫定產(chǎn)生完全應(yīng)答的患者，在治療之前體內(nèi)即有較高水平的CD28表達(dá)，而無(wú)應(yīng)答者體內(nèi)CD28表達(dá)則較低。這說(shuō)明CD28的高表達(dá)可有效提高拉米夫定抗病毒療效，T淋巴細(xì)胞表面CD28的表達(dá)水平與患者對(duì)拉米夫定的應(yīng)答有關(guān)，可作為拉米夫定療效預(yù)測(cè)的指標(biāo)。拉米夫定無(wú)免疫調(diào)節(jié)作用，但拉米夫定治療過(guò)程中卻可能導(dǎo)致患者免疫功能的變化，趙紅霞等［9］研究發(fā)現(xiàn)，拉米夫定抗病毒治療變異后機(jī)體出現(xiàn)免疫功能改變，并推測(cè)這種改變可能與治療后病毒種群變化有關(guān)。該實(shí)驗(yàn)中，各組患者經(jīng)拉米夫定治療后，其細(xì)胞表面CD28表達(dá)均較治療前提高，表明拉米夫定治療后機(jī)體細(xì)胞免疫功能有一定改善，可能與體內(nèi)病毒載量減少，病毒血癥對(duì)機(jī)體的免疫抑制作用得到緩解有關(guān)［10］。

理想的抗病毒方案應(yīng)該能夠激活足夠的免疫細(xì)胞，但盡可能減少肝細(xì)胞的損傷，并能中止病毒持續(xù)的感染。而CD28則類(lèi)似一個(gè)樞紐，與B7家族分子等構(gòu)成精密調(diào)控免疫反應(yīng)的網(wǎng)絡(luò)，在保證機(jī)體體內(nèi)免疫穩(wěn)態(tài)的同時(shí)，對(duì)外來(lái)抗原產(chǎn)生特異應(yīng)答［11］。如何有效上調(diào)體內(nèi)T淋巴細(xì)胞表面CD28的表達(dá)，充分激活T淋巴細(xì)胞，對(duì)于CHB患者的抗病毒治療有重要意義，值得進(jìn)一步探討。

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