慢性乙醇中毒小鼠海馬Caspase-3的表達

亢 勤

河南省建筑醫(yī)院內(nèi)科鄭州450001

慢性乙醇中毒性癡呆是長期大量飲酒引起軀體與精神記憶障礙相關的一類疾?。?-2］。文獻［3］報道，酒精接觸能顯著抑制與記憶力、認知相關的腦細胞的增殖，降低細胞存活率，誘導腦細胞變性、萎縮，進而出現(xiàn)一系列精神癥狀。作者建立慢性乙醇中毒模型小鼠，利用水迷宮實驗觀察其學習記憶功能的變化，免疫組織化學和免疫印跡法檢測腦組織凋亡相關蛋白Caspase-3表達的改變，探討慢性乙醇中毒引起腦功能退化的可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料 ①主要試劑:兔抗鼠激活型Caspase-3多抗購自美國Promega公司;Caspase-3 antibody購自Santa Cruz公司;FITC標記羊抗兔IgG購自北方同正生物科技有限公司。無水乙醇等其他試劑除特別注明外均為國產(chǎn)分析純。②實驗小鼠:c57BL/6小鼠由河南省實驗動物中心提供，體質(zhì)量20～30 g，雌、雄各半。單籠飼養(yǎng)，室溫控制在20～25℃，相對濕度60%～70%，定期更換墊料消毒。采光控制為8 h光照，16 h黑暗。自由進食水，食物為河南省實驗動物中心提供的小鼠標準飼料，飲用水選用實驗室自制單蒸水。

1.2 實驗分組 小鼠隨機分3組，即正常對照組、低劑量組和高劑量組，每組6只，雌雄各3只。高、低劑量組參照目前國內(nèi)通用的灌胃方式［4-5］制備慢性乙醇中毒模型:小鼠自由飲食，每日9:00禁食、水，2 h后，低劑量組灌胃無水乙醇2.4 mL/d，高劑量組灌胃無水乙醇4.8 mL/d。正常對照組灌入等量的生理鹽水。灌胃后恢復正常飼養(yǎng)。每組小鼠飼養(yǎng)期間每日16:00觀察行為學表現(xiàn)。

1.3 觀測指標

1.3.1 行為學觀察 采用Morris水迷宮實驗測定。水迷宮由圓形水池和自動錄像及分析系統(tǒng)兩部分組成。平臺位于水下2 cm，將每只動物頭部染黑，于象限邊1/2弧度處將動物頭朝池壁入水，180 s未找到站臺者，將其引至站臺，第1～2天為訓練，后3天正確到達安全島時間作為學習和記憶成績。以小鼠到達安全島的時間判斷學習記憶功能是否障礙［6-7］。

1.3.2 小鼠海馬激活型Caspase-3檢測 按照水迷宮實驗標準［6-7］，實驗小鼠出現(xiàn)學習記憶功能障礙2周后即行檢測。每組隨機取3只小鼠，斷頭取腦，多聚甲醛4℃固定48 h。PBS緩沖液沖洗，取海馬40 g/L瓊脂糖包埋，震蕩切片機(Nature Gene Co，美國產(chǎn))切片。切片經(jīng)0.1 mol/L PBS漂洗。然后加入一抗兔抗鼠激活型Caspase-3(按500倍稀釋)，置4℃冰箱中孵育過夜，PBS漂洗干凈后加入二抗，室溫下避光孵育1 h，然后用PBS漂洗3次。5 mg/L DAPI染色2 min，封片。陽性細胞胞質(zhì)或胞核棕色著色。每張切片隨機選擇9個高倍視野，每個視野計數(shù)100個細胞中的陽性細胞數(shù)，計算陽性細胞百分比。

1.3.3 小鼠海馬Caspase-3蛋白檢測 取各組剩余小鼠海馬組織適量，冷PBS洗滌2次，用總細胞蛋白裂解液200 μL，液氮下研磨，劇烈振蕩，充分裂解，冰浴30 min，4℃12 000 r/min離心15 min?？捡R斯亮藍G-250法測樣品蛋白并均衡蛋白濃度。經(jīng)電泳、切膠、轉(zhuǎn)膜，封閉后Western blotting檢測，ECL化學發(fā)光法顯示結(jié)果，壓片曝光。以β-actin作內(nèi)參照。圖像用Image J軟件進行灰度掃描，以Caspase-3與β-actin條帶光密度比值表示Caspase-3的相對表達量。

1.4 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 11.0進行分析，3組間Caspase-3蛋白表達的比較采用單因素方差分析和SNK-q檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 行為學觀察結(jié)果 對照組觀察期內(nèi)未出現(xiàn)學習記憶功能障礙，高劑量組在(14±2)d后即出現(xiàn)學習記憶功能障礙，而低劑量組在(28±3)d后也出現(xiàn)不同程度的學習記憶功能障礙，高劑量組障礙出現(xiàn)時間早于低劑量組(t=9.511，P ＜0.001)。

2.2 海馬激活型Caspase-3的表達 見表1。高劑量組海馬激活型Caspase-3陽性表達率高于低劑量組，低劑量組高于對照組。

2.3 海馬Caspase-3蛋白的表達 見圖1，表1。

圖1 慢性乙醇中毒模型鼠海馬Caspase-3蛋白的表達

表1 3組海馬Caspase-3檢驗結(jié)果

3 討論

長期過量飲酒，常引起脂肪肝、酒精性肝炎及情感及言行反應，表現(xiàn)為恐懼、焦慮不安［8］，少數(shù)可出現(xiàn)酒精中毒性精神障礙［9］，臨床多見譫妄、幻想及癡呆。神經(jīng)系統(tǒng)對酒精非常敏感，酒精可引起嚴重的細胞毒性作用，可導致神經(jīng)細胞變性壞死、分化延緩、結(jié)構(gòu)破壞，最終致中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育障礙［2，10］。

目前在慢性乙醇中毒模型建立方面，一般采用兩種模式即自由飲和灌胃［4-5］。由于考慮到灌胃方式比較接近人們的生活習慣，所以作者以灌胃方式建立慢性乙醇中毒鼠模型。Morris水迷宮實驗結(jié)果顯示模型小鼠均有一定程度的腦功能障礙，小鼠學習記憶功能明顯下降。免疫組織化學染色結(jié)果表明高、低劑量組小鼠海馬區(qū)激活型Caspase-3陽性表達率明顯高于正常對照組;免疫印跡實驗結(jié)果顯示，該2組Caspase-3總體表達高于正常對照組。Caspase-3激活與高表達是細胞啟動凋亡的有效途徑，說明慢性乙醇中毒小鼠腦細胞發(fā)生了Caspase-3依賴性凋亡。高劑量組小鼠腦功能障礙早于低劑量組，且海馬激活型Caspase-3及Caspase-3蛋白總體表達亦高于低劑量組，提示長期過量飲酒會嚴重損傷飲用者腦細胞。但是，慢性乙醇中毒誘導海馬區(qū)細胞Caspase-3激活的原因目前不清楚，可能與慢性大量酒精中毒引起海馬區(qū)細胞變性，釋放出超氧化物有關。慢性乙醇中毒引起的記憶力與認知能力下降可能與乙醇誘導腦細胞不同程度的凋亡有關。

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