重癥急性胰腺炎并腎損害大鼠腎組織Livin、Caspase-9蛋白變化及意義

劉 翼，祝 琳，周正端，張 巍，李昌平

(1瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，四川瀘州646000;2自貢市第四人民醫(yī)院)

目前，重癥急性胰腺炎(SAP)并腎損害的機(jī)制尚不完全清楚，研究認(rèn)為可能與炎癥介質(zhì)參與、微循環(huán)障礙、腎素—血管緊張素系統(tǒng)激活等有關(guān)［1］。Livin是新發(fā)現(xiàn)的凋亡抑制蛋白，半胱氨酸蛋白酶-9(Caspase-9)在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制中起關(guān)鍵作用。為探討 SAP并腎損害大鼠腎組織 Livin、Caspase-9蛋白變化及意義，2010～2011年，我們進(jìn)行了相關(guān)研究?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1．1 動(dòng)物及試劑 雄性SD大鼠90只，體質(zhì)量200～250 g，購自瀘州醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心。褪黑素(MT)購自Sigma公司;兔抗大鼠Livin、Caspase-9多克隆抗體購自北京博奧森生物公司;超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)試劑盒購自南京建成生物公司。

1．2 方法

1．2．1 動(dòng)物建模及分組 將90只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(A組)、SAP并腎損害組(SAP組)、MT干預(yù)組(MT組)各30只。術(shù)前12 h禁食、自由飲水。術(shù)時(shí)用1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠，打開腹腔，用4號(hào)靜脈針于十二指腸乳頭附近經(jīng)十二指腸壁穿刺;逆行插入胰膽管，將5%牛磺膽酸鈉1 ml/kg逆行勻速推注至胰管后退針，確認(rèn)腹腔無出血后關(guān)腹。A組開腹后僅翻動(dòng)胰腺，恢復(fù)原狀后關(guān)腹。MT組術(shù)后10 min將MT液50 mg/kg注射于大鼠背部皮下。術(shù)后各組正常進(jìn)食、飲水，6、12、24 h各處死10只。

1．2．2 血清學(xué)指標(biāo)檢測 將各組處死大鼠開胸，心臟穿刺采血3～5 ml，室溫靜置30 min后離心20 min，收集血清置－20℃保存。用全自動(dòng)生化分析儀檢測淀粉酶(AMY)、肌酐(Cr)，黃嘌呤氧化酶法檢測SOD，硫代巴比妥法檢測MDA。

1．2．3 病理組織學(xué)檢測 將處死大鼠剖腹，取胰腺及腎組織用10%甲醛固定、石蠟切片、HE染色，在光鏡下觀察其病理改變。

1．2．4 Livin、Caspase-9 蛋白檢測 用免疫組化法檢測各組腎組織Livin、Caspase-9蛋白，胞質(zhì)和(或)部分胞核內(nèi)棕黃色著色為陽性。用Biosens Digatal Imaging Systerm進(jìn)行圖像采集分析，每張圖片隨機(jī)選高倍鏡下5個(gè)有代表性的陽性區(qū)域進(jìn)行平均灰度值測定，按文獻(xiàn)方法［2］將陽性面積和平均灰度值換算成陽性單位(PU)，PU值代表陽性表達(dá)水平。

1．2．5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS14．0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料用±s表示，組間比較用單因素方差分析;檢測指標(biāo)的相關(guān)性用多元線性回歸分析。P≤0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 胰腺、腎臟組織病理變化 A組各時(shí)間點(diǎn)胰腺、腎臟組織正常。SAP組6 h胰腺腺泡腫脹，小葉局灶性壞死;腎小球毛細(xì)血管淤血，炎細(xì)胞浸潤。12 h胰腺小葉片狀壞死，間質(zhì)大量炎細(xì)胞浸潤;腎小管上皮細(xì)胞界限不清，管腔狹窄或閉鎖。24 h胰腺、部分腺葉正常結(jié)構(gòu)消失;腎小管、腎小球囊內(nèi)可見嗜伊紅染色的絮狀物和紅細(xì)胞。MT組6 h胰腺小葉間隙增寬，少量炎細(xì)胞浸潤;腎小管上皮細(xì)胞腫脹、間質(zhì)水腫。12 h胰腺間質(zhì)疏松、水腫，小葉局灶性壞死;腎小球毛細(xì)血管淤血，炎細(xì)胞浸潤增多。24 h胰腺腺泡出血、小葉片狀壞死;部分腎小管上皮細(xì)胞壞死。

2．2 各組血清AMY、Cr、MDA、SOD變化 見表1。

2．3 各組腎組織Livin、Caspase-9蛋白變化 見表2。

表1 各組血清 AMY、Cr、MDA、SOD 變化(±s)

表1 各組血清 AMY、Cr、MDA、SOD 變化(±s)

注:與 A 組比較，*P ＜0．01;與 SAP 組比較，#P ＜0．05，##P ＜0．01

組別 n AMY(U/L) Cr(μmol/L) MDA(nmol/L) SOD(U/L)A 組6 h 10 1 532．33 ± 287．18 25．34 ±1．07 6．12 ±0．12 96．23 ±6．65 12 h 10 1 623．56 ± 301．43 28．12 ±1．84 7．54 ±0．21 97．21 ±7．23 24 h 10 1 674．12 ± 313．52 30．42 ±1．92 7．76 ±0．53 97．53 ±8．04 SAP組6 h 10 2 314．24 ± 631．52* 72．12 ±2．02* 12．43 ±0．38* 76．78 ±4．91*12 h 10 3 268．58 ± 801．16* 84．57 ±2．38* 15．36 ±0．59* 63．92 ±3．25*24 h 10 5 862．87 ±1 134．43* 113．87 ±3．21* 17．89 ±0．67* 58．31 ±3．22*MT組6 h 10 1 785．61 ± 303．65## 37．24 ±1．06## 9．15 ±0．24# 98．11 ±5．45##12 h 10 1 924．11 ± 324．83## 48．57 ±2．61## 12．58 ±0．34# 84．26 ±5．01##24 h 10 3 453．25 ± 815．28## 65．87 ±3．37## 14．94 ±0．26# 72．76 ±4．21#

表2 各組腎組織Livin、Caspase-9蛋白變化(PU，±s)

表2 各組腎組織Livin、Caspase-9蛋白變化(PU，±s)

注:與 A 組比較，*P ＜0．01;與 SAP 組比較，#P ＜0．05，##P ＜0．01

組別 n Livin 6 h 12 h 24 h Caspase-9 6 h 12 h 24 h A 組 10 2．00 ±0．03 1．97 ±0．54 1．88 ±0．32 2．25 ±0．32 2．12 ±0．16 2．32 ±0．43 SAP 組 10 3．62 ±0．83* 3．38 ±0．71* 2．86 ±0．53* 6．43 ±1．28* 7．33 ±1．30* 8．21 ±1．65*MT 組 10 7．06 ±0．96## 5．86 ±1．28# 4．64 ±1．53# 4．65 ±0．87# 4．12 ±1．03# 3．89 ±0．87##

2．4 相關(guān)性分析 SAP組SOD與Cr、Caspase-9表 達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r分別為 －0．810、－0．382，P均 ＜0．05)，MDA 與 Cr、Caspase-9 表達(dá)呈正相關(guān)(r分別為0．812、0．356，P 均 ＜ 0．05);SOD、MDA 與 Livin表達(dá)無相關(guān)性(P均＞0．05)。

3 討論

SAP是臨床危重癥，14% ～43%的患者并發(fā)腎損害，發(fā)展至急性腎衰患者的病死率達(dá)71% ～84%［3］。本研究顯示，SAP組隨造模時(shí)間延長，胰腺水腫、壞死、出血逐漸加重，間質(zhì)炎細(xì)胞浸潤增多;腎臟充血、水腫、出血，腎小球、腎小管腫脹、壞死，后期見紅細(xì)胞及管型;其各時(shí)間點(diǎn)的AMY、Cr均高于A組。

有研究認(rèn)為，SAP的發(fā)生、發(fā)展可能與體內(nèi)脂質(zhì)過氧化損傷密切相關(guān)。SOD能清除氧自由基，是機(jī)體抗氧化防御系統(tǒng)的重要成員;MDA是氧自由基導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化的終產(chǎn)物之一;兩者變化可反映體內(nèi)脂質(zhì)過氧化程度。本研究表明，隨SAP造模時(shí)間延長，SOD逐漸降低，MDA逐漸升高;且SOD與Cr呈負(fù)相關(guān)，MDA與Cr呈正相關(guān)，說明脂質(zhì)過氧化可能參與腎損害。其可能機(jī)制是SAP時(shí)氧自由基形成增多，使脂質(zhì)形成脂質(zhì)過氧化物，脂質(zhì)過氧化反應(yīng)致胰腺組織損傷;大量SOD消耗使血中SOD下降，難以對抗脂質(zhì)過氧化對胰外組織的損傷。

Caspase-9為凋亡始動(dòng)子，能在其他蛋白參與下發(fā)生自我活化并激活下游的 Caspase。1993年，Crook等［4］首先在桿狀病毒CpGV、OPMNPV中發(fā)現(xiàn)并分離出凋亡抑制蛋白(IAPs)，其在腦、胸腺、腎、肝臟等組織高表達(dá)［5］。Livin屬于 IAPs家族新成員。本研究顯示，SAP組各時(shí)間點(diǎn)Livin、Caspases-9表達(dá)均高于A組，且隨時(shí)間延長，Livin、SOD逐漸降低，Caspases-9、MDA逐漸升高;SOD與Caspase-9表達(dá)均呈負(fù)相關(guān)，MDA與Caspase-9表達(dá)均呈正相關(guān)。說明Livin、Caspase-9表達(dá)可能與SAP并腎損害相關(guān)，脂質(zhì)過氧化可能與其存在密切關(guān)系。

MT是具有強(qiáng)大抗氧化作用的吲哚類激素，可清除自由基，減輕急性炎癥反應(yīng)［6］。本研究發(fā)現(xiàn)，與SAP組比較，MT組 AMY、Cr、MDA 下降，SOD 升高;Livin升高，Caspase-9降低。表明MT有抗氧化功能，并通過升高Livin、降低Caspase-9起到改善腎功能的作用。SAP組SOD、MDA與Livin表達(dá)均無相關(guān)性，提示脂質(zhì)過氧化與Livin表達(dá)無關(guān);但用MT干預(yù)后Livin下降，提示MT可能通過抗炎作用等途徑增強(qiáng)Livin表達(dá)，抑制凋亡作用。

總之，本研究顯示Livin、Caspase-9蛋白變化可能參與SAP大鼠的腎損害，外源性MT對SAP并腎損害有保護(hù)作用，其機(jī)制可能是通過抗脂質(zhì)過氧化、提高Livin、降低Caspase-9表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。

［1］Cunnecn J，Cartwright M．The puzzle of sepsis:fitting the pieces of the inflammatory response with treatment［J］．AACN Clin Issues，2004，15(1):18-44．

［2］弓娟琴，陳志強(qiáng)，李文忠，等．Fas介導(dǎo)的凋亡與 Caspase家族［J］．國外醫(yī)學(xué):腫瘤學(xué)分冊，2001，27(5):279-280．

［3］Pupelis G．Renal failure in acute pancreatitis，timing of dialysis and surger［J］．Przegl Lek，2000，57(Suppl 5):29-31．

［4］Crook NE，Clem RJ，Miller LK．An apoptosis-inhibiting baculovirus gene with a zinc finger-like motif［J］．J Virol，1993，67(4):2168-2174．

［5］Vucic D，Stennieke HR，Pisabarro MT，et al．ML-IAP，a novel inhibitor of apoptosis that is preferentially expressed in human melanomas［J］．Curr Biol，2000，10(21):1359-1366．

［6］Li JH，Yu JP，Yu HG，et al．Melatonin reduces inflammatory injury through inhibiting NF-kappa B activation in rats with colitis［J］．Mediators Inflamm，2005(4):185-193．