嗜麥芽窄食單胞菌磺胺類(lèi)耐藥與整合子的相關(guān)性研究

杜江東，牟肖東，閆志勇，王 斌*

(1青島大學(xué)，青島266071;2青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬煙臺(tái)毓璜頂醫(yī)院)

嗜麥芽窄食單胞菌(SMA)廣泛存在于自然界，為條件致病菌，由于其致病力低，臨床上一直未引起重視?；前奉?lèi)藥物是治療SMA有效藥物之一，但近年來(lái)報(bào)道其耐藥率不斷增加，并與整合子有關(guān)。2010年5月～2011年5月，本研究以51株SMA為研究對(duì)象，觀察了其磺胺耐藥基因和整合子的存在情況。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1．1 材料 菌株來(lái)源:51株SMA分離自煙臺(tái)毓璜頂住院患者臨床標(biāo)本，其中大于60歲者38例，占74．5%;45例分離自痰標(biāo)本，占88．2%。標(biāo)準(zhǔn)菌株為大腸埃希菌ATCC25922和銅綠假單胞菌ATCC27853。主要試劑及儀器:VITEK-AMS菌種鑒定系統(tǒng)(法國(guó)生物一梅里埃公司)、M-H瓊脂(杭州天和生物)、ABl7000 PCR擴(kuò)增儀(美國(guó)ABI)、凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司)、瓊脂糖(美國(guó)Bio-Rad公司)。

1．2 藥敏試驗(yàn) 采用M-H瓊脂，以K-B法進(jìn)行抗生素敏感性試驗(yàn)，操作及結(jié)果判讀嚴(yán)格按照臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLSI-NCCLS)2010年公布的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判斷。

1．3 基因檢測(cè) DNA模板的制備:用加熱裂解法，將過(guò)夜培養(yǎng)的細(xì)菌置于60 μl、pH 8．0的TE緩沖液(10 mmol/L Tris．Cl和 1 mmol EDTA)中，配成一定濃度的菌懸液，并振蕩混勻。將菌懸液放入97℃水浴中10 min，－20℃放置1 min，12 000 r/min離心5 min后取上清，于－20℃放置備用。

1．4 基因擴(kuò)增 采用PCR法。根據(jù)參考文獻(xiàn)［1，2］設(shè)計(jì) int1、int2、int3、sulⅠ基因引物。反應(yīng)體系:反應(yīng)體積為 50 μl，Premix Taq PCR 反應(yīng)液 25 μl，基因模板 2 μl，引物各 1 μl，滅菌蒸餾水 21 μl。整合子基因擴(kuò)增條件:預(yù)變性94℃ 5 min;變性94℃ 30 s，退火55℃30 s，延伸72℃ 60 s;再延伸72℃ 2 min。sulⅠ基因擴(kuò)增條件:預(yù)變性94℃ 5 min;變性94℃ 30 s，退火55℃ 30 s，延伸72℃ 60 s;再延伸72℃ 2 min。取擴(kuò)增產(chǎn)物10 μl與2 μl的6×上樣緩沖液混勻，點(diǎn)樣于2%瓊脂糖凝膠中，以100 V電壓電泳30 min，紫外檢測(cè)儀中觀察結(jié)果，凝膠成像系統(tǒng)采集圖像并保存。以出現(xiàn)與陽(yáng)性對(duì)照分子量相同的目的條帶判為陽(yáng)性。

2 結(jié)果

2．1 藥敏試驗(yàn) 結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

2．2 基因檢測(cè)結(jié)果 7株(13．7%)Ⅰ類(lèi)整合子陽(yáng)性，沒(méi)有檢測(cè)到Ⅱ、Ⅲ類(lèi)整合子，12株菌(23．5%)sulⅠ陽(yáng)性。其中有9株耐SXT檢測(cè)到sulⅠ基因，6株同時(shí)檢測(cè)到intⅠ。3株SXT耐藥表型沒(méi)有檢測(cè)到sulⅠ基因。

3 討論

SMA已經(jīng)成為非發(fā)酵菌中占第3位的細(xì)菌，由于它的天然多重耐藥，使得臨床治療相當(dāng)困難，治療其感染首選藥物為復(fù)方磺胺，但是近幾年其對(duì)磺胺耐藥呈上升趨勢(shì)，耐藥機(jī)制的研究也成為熱點(diǎn)。

sulⅠ基因?yàn)槎淙~酸合成酶的編碼基因，陽(yáng)性提示細(xì)菌對(duì)磺胺類(lèi)藥物耐受，Barbolla等［3］研究31株SMA，3株表現(xiàn)為對(duì)SXT最低抑菌濃度高，經(jīng)特異引物擴(kuò)增出sulⅠ基因，同時(shí)還檢測(cè)到intⅠ基因。Toleman等［4］收集103株臨床分離的SMA，25%的菌株經(jīng)瓊脂稀釋法檢測(cè)到是耐SXT的，26株耐SXT SMA中21株含有 sulⅠ基因，81%存在Ⅰ類(lèi)整合子上。Correia等［5］對(duì)55株SMA研究發(fā)現(xiàn)，25株耐SXT的菌株中，17株攜帶sulⅠ基因，而SXT敏感的菌株中沒(méi)有sulⅠ基因。以上研究表明sulⅠ基因是SMA對(duì)SXT耐藥的主要基因，sulⅠ與Ⅰ類(lèi)整合子關(guān)系密切。

整合子—基因盒系統(tǒng)屬于可移動(dòng)基因元件，可位于細(xì)菌的染色體上，也可借助于移動(dòng)的質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子在同種或不同種細(xì)菌之間水平傳播，對(duì)細(xì)菌耐藥性的傳播產(chǎn)生作用。整合子根據(jù)整合酶基因的不同分類(lèi)，迄今已發(fā)現(xiàn)10類(lèi)整合子，在臨床菌株中常見(jiàn)的為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ類(lèi)整合子，其中尤以Ⅰ類(lèi)整合子最常見(jiàn)。雖然目前Ⅰ類(lèi)整合子在SMA中的攜帶率不高，但是整合子機(jī)制參與了多重耐藥的水平傳播，因其高效性，應(yīng)引起足夠的重視，可采取積極有效的措施控制耐藥基因的水平轉(zhuǎn)移。

本實(shí)驗(yàn)中，sulⅠ基因陽(yáng)性12株，其中9株表現(xiàn)為SMZ耐藥表型符合率75%，1株SXT耐藥sulⅠ基因陰性可能與其他耐藥機(jī)制如泵蛋白、膜通透性等有關(guān)。6株SXT耐藥同時(shí)檢測(cè)到sulⅠ基因與intⅠ基因，表明SXT耐藥與Ⅰ類(lèi)整合子存在相關(guān)，Ⅰ類(lèi)整合子作為細(xì)菌耐藥傳播的重要機(jī)制可能將使磺胺類(lèi)藥物的應(yīng)用受到一定限制。

［1］周月清，陸開(kāi)來(lái)．鮑氏不動(dòng)桿菌耐消毒劑——磺胺基因、Ⅰ類(lèi)整合酶基因及氨基糖苷類(lèi)修飾酶基因研究［J］．中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2005，15(7):728-73l．

［2］黃支密，糜祖煌，石曉霞，等．醫(yī)院感染革蘭陰性桿菌耐消毒劑基因研究［J］．中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2005，15(7):721-724．

［3］Barbolla R，Catalano M，Orman BE，et al．ClassⅠ integron increase trimethoprim-sulfamethoxazole MIC，againstepidemiologically unrelated stenotrophomonas maltophiliaisolates［J］．Antimicrob A-gent Chemother，2004，48(2):666．

［4］Toleman MA，Bennett PM，Bennett DM，et al．Global emergence of trimethoprim sulfamethoxazole resistance in Stenotrophomonasmaltophilia mediated by acquisition of sul genes［J］．Emerg Infect Dis，2007，13(2):559-659．

［5］Correia M，Boavida F，Grosso F，et al．Molecular characterization of a new class 3 integron in Klebsiella pneumoniae［J］．Antimicrob Agents Chemother，2003，47(9):2838-2843．