痰液標(biāo)本結(jié)核分支桿菌RNA恒溫?cái)U(kuò)增檢測及臨床應(yīng)用

王永忠，張宏宇，劉小琴，朱 珍，柳龍根，張 剛，屠文俊，韋生坤

(常州市第三人民醫(yī)院，江蘇常州213001)

目前結(jié)核病的實(shí)驗(yàn)室診斷主要包括痰涂片法、培養(yǎng)法、分子生物學(xué)方法、免疫學(xué)方法等［1］。近年來，以病原體RNA為擴(kuò)增靶標(biāo)的核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測(SAT)技術(shù)開始應(yīng)用于病原體的核酸診斷。我們應(yīng)用SAT技術(shù)對肺結(jié)核患者痰液標(biāo)本中的結(jié)核分支桿菌(TB)RNA進(jìn)行檢測，并與PCR法檢測TB DNA及痰培養(yǎng)、痰涂片抗酸染色直接鏡檢法檢測TB的結(jié)果進(jìn)行了比較。現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 資料與方法

1．1 臨床資料 選擇2010年3月～2011年6月臨床確診為肺結(jié)核并接受治療的住院患者131例，男85例、女46例，年齡(49．87 ±17．62)歲;73例非結(jié)核性肺部感染患者為同期本院呼吸科住院患者，男45 例、女28 例，年齡(45．71 ±16．9)歲。

1．2 標(biāo)本采集及保存 痰液標(biāo)本均為清晨收集，一部分直接做痰涂片抗酸染色，剩余標(biāo)本取1．5 ml左右于5 ml離心管中，加入1～2倍體積的4%NaOH于無菌樣品管中，旋渦振蕩混勻，室溫放置15～20 min。13 000 r/min離心5 min，棄上清，再加入1 ml生理鹽水重懸洗滌，13 000 r/min離心5 min，棄上清。處理后標(biāo)本可直接用于痰培養(yǎng)、SAT、PCR檢測或－80℃凍存。

1．3 SAT檢測 引物及探針序列:TB nT7:5'-gagtggcgaacgggtgagtaac-3'，TB T7:5'-aatttaatacgactcactatagggagacaccaacaagctgataggccgcgg-3'，TB Probe:5'-cgu ccggataggaccacgggacg-3'。RNA提取:液化處理后的痰液標(biāo)本加入50 μl TB稀釋液重懸后與50 μl陽性對照、50 μl陰性對照一起放入超聲波處理器中進(jìn)行超聲處理，超聲波功率為300 W，處理時(shí)間15 min。超聲處理結(jié)束后的產(chǎn)物即可作為檢測反應(yīng)的模板。反應(yīng)體系:將試劑平衡到室溫(18～26℃)，充分混勻，按照每個(gè)樣品取 28 μl TB 反應(yīng)液和 2．0 μl TB檢測液計(jì)算，配制所需擴(kuò)增檢測液，振蕩混勻，3 000～4 000 r/min離心10 s備用。擴(kuò)增檢測:取 2 μl RNA模板加入含30 μl擴(kuò)增檢測液的微量反應(yīng)管，置干熱恒溫器上60℃保溫10 min，恒溫混勻儀上42℃保溫5 min，同時(shí)將SAT酶液也預(yù)熱到42℃;在ABI 7500熒光定量PCR儀上設(shè)置恒溫檢測參數(shù)，熒光檢測通道設(shè)定為FAM;42℃ 1 min，40個(gè)循環(huán);熒光信號(hào)收集每分鐘進(jìn)行一次，共檢測40次;向保持于42℃恒溫混勻儀的微量反應(yīng)管中加入10 μl已預(yù)熱的酶液，蓋上管蓋1 200 r/min振蕩15 s混勻，快速轉(zhuǎn)至ABI 7500實(shí)時(shí)定量PCR儀，立即啟動(dòng)反應(yīng)程序;根據(jù)CT值判斷結(jié)果。

1．4 PCR檢測TB DNA、痰培養(yǎng)法檢測TB 采用深圳匹基生物和生物梅利埃提供的試劑盒或儀器，并嚴(yán)格按說明書操作。痰涂片抗酸染色法嚴(yán)格按照中國防癆協(xié)會(huì)“結(jié)核病診斷實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程”操作，采用齊—尼(Zield-Neehen)抗酸染色法進(jìn)行痰標(biāo)本處理、涂片、染色，按照鏡檢300個(gè)視野分級報(bào)告標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。

1．5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17．0統(tǒng)計(jì)軟件，結(jié)果比較用配對χ2檢驗(yàn)，靈敏度及特異度等指標(biāo)比較采用χ2檢驗(yàn)。P≤0．05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2．1 不同檢測方法TB陽性檢出率結(jié)果比較 131例肺結(jié)核患者痰液標(biāo)本中，SAT法TB陽性檢出率為52．67%(69/131);PCR法陽性檢出率為50．38%(66/131);痰培養(yǎng)法陽性檢出率為39．69%(52/131);痰涂片抗酸染色法陽性檢出率為35．11%(46/131)。經(jīng)χ2檢驗(yàn)，SAT法檢出率明顯高于痰培養(yǎng)法(χ2=4．438，P=0．035)和痰涂片法(χ2=8．199，P=0．004)。73例非結(jié)核性肺部感染者四種方法均未檢測到痰液標(biāo)本中TB或其核酸的存在。

2．2 細(xì)菌學(xué)檢測結(jié)果與核酸檢測結(jié)果比較 131例肺結(jié)核患者痰液標(biāo)本中，痰涂片及痰培養(yǎng)檢測結(jié)果均為陰性的73例，SAT法檢測出15例，PCR法檢測出13例，見表1。

表1 細(xì)菌學(xué)與核酸檢測結(jié)果

2．3 SAT法與PCR法檢測結(jié)果比較 用PCR法檢測結(jié)果作為參考標(biāo)準(zhǔn)，SAT法靈敏度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值分別是 95．38%、90．91%、91．18%、95．24%。二者符合率為 93．89%。對兩種方法的檢測結(jié)果進(jìn)行配對χ2檢驗(yàn)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0．289)，結(jié)果見表 2。

表2 SAT法與PCR法檢測結(jié)果

3 討論

世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，全球已有20億人感染了TB，占全球人口三分之一，其中活動(dòng)性肺結(jié)核患者達(dá)2 000萬，TB的感染已經(jīng)成為嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題。建立早期、靈敏、準(zhǔn)確、快速的檢測方法對結(jié)核病的診斷、治療和防控具有重要意義。

隨著生物技術(shù)的快速發(fā)展，結(jié)核病的實(shí)驗(yàn)室診斷方法已經(jīng)取得了一定的進(jìn)展，傳統(tǒng)的痰培養(yǎng)法需要3～8周，改進(jìn)后的Bactec快速培養(yǎng)系統(tǒng)使培養(yǎng)時(shí)間縮短至15 d左右，但該方法只能檢測出活力旺盛的菌，對活力差或死菌則無法檢出［2］;痰涂片法受到標(biāo)本取材、患者自身間斷性的排菌、標(biāo)本中菌的數(shù)量級大小等多種因素的影響導(dǎo)致其敏感度較低［3］;分子生物學(xué)方法在近年的TB檢測中得到了長足發(fā)展，其中PCR技術(shù)發(fā)展較為迅速，它能快速、準(zhǔn)確、靈敏地檢出TB DNA，但成本和技術(shù)要求較高，易出現(xiàn)假陽性［4］;繼PCR之后，又發(fā)展了幾種新的核酸體外擴(kuò)增技術(shù)，如Amplicor PCR、AMTDT等，它們都具有高度的靈敏性和準(zhǔn)確性，但Amplicor PCR在操作上仍需進(jìn)一步自動(dòng)化以避免手工重復(fù)操作，AMTDT法能檢測出無活力菌中的rRNA，不能用于監(jiān)測化療效果［5］。由于AMTDT不能鑒別 TB和MOTT，也不能進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，因此不能代替?zhèn)鹘y(tǒng)的培養(yǎng)法［6］。

SAT技術(shù)具有高靈敏度和高準(zhǔn)確性的優(yōu)點(diǎn)，其技術(shù)原理是在同一溫度下，首先通過M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶產(chǎn)生靶標(biāo)核酸(RNA)的一個(gè)雙鏈DNA拷貝，然后利用T7 RNA多聚酶從該DNA拷貝上產(chǎn)生多個(gè)(100～1 000個(gè))RNA拷貝，每一個(gè)RNA拷貝再從反轉(zhuǎn)錄開始進(jìn)入下一個(gè)擴(kuò)增循環(huán)。同時(shí)，帶有熒光標(biāo)記的探針和這些RNA擴(kuò)增子特異結(jié)合，產(chǎn)生熒光。該熒光信號(hào)可由熒光檢測儀器實(shí)時(shí)捕獲，從而實(shí)時(shí)反映擴(kuò)增情況。本研究以SAT的16 s rRNA作為檢測靶標(biāo)，對131例肺結(jié)核患者痰液進(jìn)行SAT，盡管由于接受結(jié)核治療而使病原菌的活力及數(shù)量大大減少，SAT法仍能檢出69例陽性痰液，檢出率為52．67%，明顯高于痰培養(yǎng)法的39．69%和痰涂片法的35．1%，非結(jié)核性肺部感染者用SAT未檢測到痰液標(biāo)本中TB核酸的存在，提示SAT應(yīng)用于TB RNA的檢測具有較高的靈敏度和特異性，可臨床推廣應(yīng)用。

［1］趙雁林．結(jié)核病的實(shí)驗(yàn)室診斷方法［J］．中國社區(qū)醫(yī)師，2008，24(1):10-11．

［2］王易偉，胡頻頻．rRNA擴(kuò)增直接檢測結(jié)核分枝桿菌的臨床應(yīng)用價(jià)值探討［J］．中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2005，28(1):543-544．

［3］李強(qiáng)，陸其斌．影響痰涂片抗酸桿菌檢出率的因素分析［J］．檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床，2011，8(1):64-65．

［4］Speers DJ．Clinical applications of molecular biology for infectious diseases［J］．Clin Biochem Rev，2006，27(1):39-51．

［5］Gamboa F，Manterold JM，Vinado B，et al．Direct detection of mycobacterium tuberculosis complex in nonrespiratory specimens by gen-probe amplified mycobacterium tuberculosis direct test［J］．J Clin Microbiol，1997，35(1):307-310．

［6］吳龍章，蔡杏珊，吳幸怡，等．四種檢測方法對結(jié)核病臨床診斷價(jià)值的探討［J］．中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2007，30(7):742-745．