急性腦出血患者外周血sFas和sFasL的變化及意義

王兆平，王文靜，時 鵬，王前友，潘 健，馬俊芳，吳 蕾

(安徽醫(yī)科大學附屬省立醫(yī)院，合肥230001)

腦出血是嚴重威脅人類健康及生活質(zhì)量的常見疾病，其病死率和致殘率較高。近年來，國內(nèi)外許多研究表明，細胞凋亡機制參與了腦出血所致的神經(jīng)損傷，且與病情的嚴重程度密切相關(guān)。Fas系統(tǒng)(CD95或APO-1)及其配體FasL(CD178)是細胞凋亡調(diào)控信號途徑的一個重要部分，可溶性Fas(sFas)和可溶性Fas配體(sFasL)分別是Fas和Fas配體(FasL)的可溶形式。sFas/sFasL與各種腫瘤、缺血性心臟病、肝病、腎病、免疫系統(tǒng)疾病的發(fā)病機制及預后關(guān)系密切，但與腦出血的關(guān)系國內(nèi)外報道較少。本研究通過對急性腦出血(ACH)患者外周血清sFas和sFasL水平的動態(tài)觀察，探討其變化與急性期出血灶部位、大小及形態(tài)之間的關(guān)系，為ACH病情變化的判斷和治療提供了新的理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 根據(jù)1995年第四屆全國腦血管病會議修訂的診斷標準，共收集2010年3～12月在安徽醫(yī)科大學附屬安徽省立醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科住院的ACH患者60例(ACH組)，男43例、女17例，年齡40～88(62.61±13.85)歲?；颊呔诎l(fā)病6 h內(nèi)入院，經(jīng)頭顱CT確診并接受內(nèi)科治療。擇同期無腦血管疾病體檢者30例作為對照組，其中男20例、女10例，年齡47～79(60.96±10.26)歲。排除標準:①腦梗死后出血;②已知可影響血清sFas和sFasL水平的其他疾病(風濕病、腫瘤、肝腎疾病、急性創(chuàng)傷出血、感染及心腦血管疾病等);③血液病(白血病、再生障礙性貧血、血小板減少性紫癜、血友病等)所致出血;④外傷性顱內(nèi)出血;⑤抗凝劑或溶栓劑所致出血;⑥入院后14 d內(nèi)死亡。ACH組高血壓病史20例，糖尿病史5例，高脂血癥史5例，吸煙12例，飲酒15例，心腦血管病家族史6例;對照組分別為4、2、3、5、6、2 例。ACH 組高血壓史高于對照組(P＜0.01)，其余無統(tǒng)計學差異。

1.2 方法 患者進行頭顱CT檢查后將圖像輸送至工作站，由兩位放射科醫(yī)師使用三維重建軟件包VOXTOOL 2.0.0OH對原始掃描數(shù)據(jù)進行3D重建，用表面遮蓋法測量出血灶的體積，記錄其大小、部位、形狀。按照出血灶容積大小分為，少量出血組(＜20 ml)、中量出血組(20～50 ml)、大量出血組(＞50 ml);按照出血灶部位分為基底節(jié)區(qū)出血組、腦葉出血組、腦干出血組(本研究中無小腦及腦室出血);按照出血灶形狀分為類圓形組、梭形組、不規(guī)則形組。ACH 組于發(fā)病后 6 h、24 h、2 d、7 d、14 d及對照組抽取空腹肘靜脈血4 ml裝于EDTA管中，室溫下靜置30～60 s后，以4 000 r/min離心10min(白洋B600-A低速離心機)，收集血清裝于無熱原和內(nèi)毒素試管內(nèi)編號后，放置－70℃冰箱貯存待檢，避免反復解凍。采用ELISA法測定血清sFas和sFasL，sFas及sFasL試劑盒由美國R＆D有限公司提供，操作嚴格按照試劑盒說明書進行，測定標本在450 nm波長下的吸光度值(OD值)，根據(jù)標準曲線的直線回歸方程計算出樣品的濃度。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件，計量資料以±s表示，兩組間比較采用兩獨立樣本的t檢驗;多組間均數(shù)的比較采用one-way ANOVA法，多組間資料兩兩比較采用LSD、SNK法;兩因素間相關(guān)性應用Spearman相關(guān)分析。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 ACH患者不同時間血清sFas、sFasL水平變化見表1。

2.2 ACH患者不同大小出血灶sFas、sFasL血清峰值比較 見表2。

2.3 ACH患者不同形狀出血灶血清sFas和sFasL峰值比較 見表3。

2.4 ACH患者不同出血部位血清sFas和sFasL峰值比較 見表4。

表1 ACH 患者不同時間血清、sFas、sFasL 變化(pg/ml，±s)

表1 ACH 患者不同時間血清、sFas、sFasL 變化(pg/ml，±s)

注:與對照組比較，*P ＜0.05

sFas sFasL ACH組組別 n 60 6 h 143.66 ± 30.08* 190.31 ±30.23*24 h 294.62 ± 90.28 368.57 ±76.28*2 d 705.19 ±196.38* 251.72 ±53.17*7 d 408.51 ±111.83* 191.38 ±42.49*14 d 271.63 ± 50.27 120.62 ±25.88對照組30 289.83 ± 47.18 109.40 ±21.34

表2 ACH患者不同大小出血灶血清sFas、sFasL峰值比較(pg/ml，±s)

表2 ACH患者不同大小出血灶血清sFas、sFasL峰值比較(pg/ml，±s)

注:各組間兩兩比較，P均＜0.01

組別 n 48 h sFas 24 h sFasL少量出血組30 469.87 ±138.15 268.25 ±79.59中量出血組 25 708.73 ±142.13 427.50 ±88.27大量出血組 5 991.11 ± 79.53 546.85 ±70.83對照組30 289.83 ± 47.18 109.40 ±21.34

表3 ACH患者不同形狀出血灶血清sFas和sFasL峰值比較(±s)

表3 ACH患者不同形狀出血灶血清sFas和sFasL峰值比較(±s)

注:與對照組比較，*P ＜0.01;與其他組比較，▲P ＜0.01

組別 n 出血灶大小(ml)48 h sFas(pg/ml)24 h sFasL(pg/ml)不規(guī)則形組 24 27.79 ±22.74 728.89 ±220.78＊▲ 395.42 ±145.68＊▲梭形組 22 24.80 ±27.63 617.78 ±213.49* 355.16 ±126.18*類圓形組 14 23.44 ±29.84 583.94 ±172.19* 355.82 ±118.01*對照組組30 － 289.83± 47.18 109.40± 21.34

表4 ACH患者不同出血部位血清sFas和sFasL峰值濃度比較(±s)

表4 ACH患者不同出血部位血清sFas和sFasL峰值濃度比較(±s)

注:與其他組比較，*P ＜0.01

組別 n 出血灶大小(ml)48 h sFas(pg/ml)24 h sFasL(pg/ml)基底節(jié)區(qū)出血組 42 32.73 ±24.26 749.59 ±212.94*405.64 ±158.48*腦葉出血組 14 28.08 ±28.83 611.37 ±207.63 348.56 ±119.28腦干出血組 4 3.12 ± 2.16*596.34 ±167.29 350.67 ±120.18對照組30 － 289.83± 47.18 109.40± 21.34

3 討論

目前誘導細胞凋亡機制仍不十分明確，F(xiàn)as系統(tǒng)是介導細胞凋亡的一個重要途徑［1］。腦出血后由于血腫周圍繼發(fā)性缺血、凝血酶釋放、血紅蛋白分解、補體激活、炎性細胞浸潤、自由基升高和多種細胞因子表達等，均可激活Fas/FasL系統(tǒng)，從而誘導細胞凋亡的發(fā)生，且細胞凋亡代表著腦出血后細胞死亡的主要方式［2］。本研究也支持這一觀點。

Fas(Apo-1，CD95)是神經(jīng)壞死因子和神經(jīng)生長因子受體家族的一員，分子量為45～52 kD，屬于Ⅰ型跨膜糖蛋白受體。人類Fas分子由325個氨基酸殘基組成，其結(jié)構(gòu)包括一個具有-NH2末端的胞外區(qū)、位于分子中部含有17個氨基酸殘基的跨膜區(qū)和含有145個氨基酸殘基的胞內(nèi)區(qū)。位于胞內(nèi)區(qū)有一段有70～80個氨基酸殘基組成的區(qū)域，稱為“死亡結(jié)構(gòu)域”，此區(qū)對于引導細胞凋亡必不可少。人類Fas分子包含膜結(jié)合型(mFas)和游離型(sFas)兩種，sFas可游離于血液中，是Fas基因mRNA變異使其跨膜區(qū)63 bp的編碼序列丟失所致，可與FasL結(jié)合，不具有活性，從而抑制凋亡的發(fā)生。FasL也屬于腫瘤壞死因子超家族，分子量約為40 kD，屬于Ⅱ型膜蛋白，由218個氨基酸殘基組成。sFasL是FasL被金屬蛋白酶水解產(chǎn)生的，也分布于細胞外，可與Fas結(jié)合誘導凋亡的發(fā)生。

本研究結(jié)果表明，ACH后存在細胞凋亡的參與，血清sFas在ACH患者發(fā)病6 h低于對照組，于24 h與對照組相當，48 h明顯高于對照組，以后逐漸下降。而血清sFasL在6 h高于對照組，于24 h達高峰，然后逐漸下降，兩者于14 d左右接近正常。這與Delgado等［3］報道一致。提示在ACH早期，由于出血灶周圍產(chǎn)生多種細胞因子，刺激腦細胞膜上Fas抗原表達上調(diào)，F(xiàn)as的死亡域分別與FasL相關(guān)的死亡域結(jié)合和帶有內(nèi)源性死亡域的接頭蛋白相互作用，激活Caspases，促進神經(jīng)細胞凋亡，從而誘導FasL、sFasL表達上調(diào)，與此同時腦細胞分泌sFas，其與FasL、sFasL結(jié)合，阻斷FasL及sFasL提供的凋亡信號，而抑制細胞凋亡。ACH患者血清中sFas在開始6 h下降，而后迅速增多，考慮機體的自我保護作用阻止神經(jīng)細胞過度凋亡。本研究結(jié)果也顯示血清sFas、sFasL峰值隨著出血灶的增大而增高，表明其與腦出血的嚴重程度密切相關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)，出血灶形狀與血清sFas、sFasl水平有一定的相關(guān)性，表現(xiàn)為在相同容積的出血情況下，不規(guī)則形出血較類圓形及梭形表達更高的sFas、sFasl水平;而圓形和梭形出血之間sFas、sFasL水平表達相當，說明不規(guī)則出血灶可以引起更嚴重的細胞凋亡，對周圍腦組織產(chǎn)生相對嚴重的損害。病理學資料研究表明，規(guī)則型腦出血血凝塊易于清除，與周圍腦組織無明顯粘連;不規(guī)則型腦出血的血凝塊與周圍腦組織粘連較緊密，不易清除，并可見條索狀結(jié)構(gòu)伸入周圍腦組織，且出血較多，呈噴射狀，系動脈出血。可見不規(guī)則型腦出血患者出血灶周圍腦組織損傷及血腦屏障(BBB)細胞凋亡的發(fā)生，產(chǎn)生更多的凋亡因子(如sFasL)，機體也保護性地產(chǎn)生更多的凋亡抑制因子(如sFas)，抑制細胞凋亡。這些因子可通過破壞的BBB進入血液，導致其在血液濃度增高。國內(nèi)外學者研究也顯示，ACH血腫形態(tài)不規(guī)則常提示易出現(xiàn)活動性出血，其發(fā)生血腫擴大的發(fā)生率較類圓形及梭形大，預后較差［4］。本研究從凋亡水平進一步驗證了這一結(jié)論。

本研究還發(fā)現(xiàn)，基底節(jié)區(qū) ACH患者的血清sFas、sFasL的峰值較腦葉、對照組高，且腦干出血雖出血量較少，其血清sFas、sFasL的峰值與其他部位出血相當，推測可能是基底節(jié)區(qū)和腦干與大腦和小腦等存在廣泛的神經(jīng)纖維聯(lián)系，血腫形成早期紅細胞及其分解產(chǎn)物、自由基、中性粒細胞及炎癥介質(zhì)等在脈壓差的動力作用下，通過神經(jīng)纖維間隙及血管周圍間隙向遠離出血灶的部位流注，而誘導這些部位神經(jīng)元細胞與神經(jīng)膠質(zhì)細胞發(fā)生凋亡，甚至導致腦出血后發(fā)生繼續(xù)出血。本研究結(jié)果顯示，基底節(jié)部位的出血較其他部位發(fā)生繼續(xù)出血的可能性大，與沈斌［5］研究結(jié)果一致。本研究中，基底節(jié)區(qū)、腦干部位出血，不僅產(chǎn)生嚴重的神經(jīng)功能癥狀，而且可誘導嚴重的腦細胞凋亡，影響腦細胞正常功能。因本研究的病例數(shù)較少，仍需大樣本的研究進一步證實。

Ackery等［6］研究顯示，在1個脊髓損傷的動物模型中，經(jīng)蛛網(wǎng)膜下腔給予sFas受體，可使更多的神經(jīng)元和少突膠質(zhì)細胞存活并改善神經(jīng)癥狀。因此，為預防和減輕ACH后的細胞凋亡引起的繼發(fā)性神經(jīng)細胞損傷，針對sFas、sFasL表達的特點，積極采取相應的干預對策，可能是降低ACH的病死率和提高存活者生活質(zhì)量的有效途徑之一。

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［3］Delgado P，Cuadrado E，Rosell A，et al.Fas system activation in perihematomal areas after spontaneous intracerebral hemorrhage［J］.Stroke，2008，39(6):1730-1734.

［4］Sorimaehi T，F(xiàn)ujii Y，Morita K，et al.Predictors of hematoma enlargement in patients with intracerebral hemorrhage treated with rapid administration of antifibrinolytic agents and strict blood pressure control［J］.J Neurosurg，2007，106(2):250-254.

［5］沈斌.腦出血后繼續(xù)出血的臨床研究［J］.山東醫(yī)藥，2010，50(40):106.

［6］Ackery A，Robins S，F(xiàn)ehlings MG，et al.Inhibition of Fas-mediated apoptosis through administration of soluble Fas receptor improves functional outcome and reduces posttraumatic axonal degeneration after acute spinal cord injury［J］.J Neuro Trauma，2006，23(5):604-616.