CpG ODN誘導人PBMC對結腸癌細胞體外殺傷作用的研究

韓 剛,李金龍,賈明庫

(吉林大學第二醫(yī)院普通外科,吉林長春130041)

大腸癌是最常見的惡性腫瘤之一,目前治療原則以手術為主。而對于手術切除困難甚至失去手術機會的患者目前仍是困擾臨床醫(yī)生的難題。近年來腫瘤的生物治療研究較多,并取得了一定的療效與進步。本文通過觀察以CpG ODN為免疫佐劑,聯(lián)合應用腫瘤凍融抗原和IL-2激活PBMC,對其增殖活性、腫瘤殺傷活性及T亞群活性的影響,探討CpG ODN作為佐劑在抗腫瘤免疫中的作用,尋找合理的腫瘤免疫治療方法。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1病例選擇 分別選取本院健康志愿者和結腸癌患者各5人進行采血,量為20 ml,采血后2 h內分離。

1.1.2腫瘤細胞株、CpG2006和IL-2 人結腸癌細胞株SW1116購自吉林省腫瘤研究所;CpG 2006由上海生工生物技術服務公司合成;IL-2購自長生基因藥業(yè)股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1人PBMC的分離 每份血樣中加入等量生理鹽水混勻稀釋,加3 ml淋巴細胞分離液,離心。分離出離心分層后單個核細胞層,另加入RPMI1640后離心,洗滌2次。計算活細胞百分數(shù)＞95%。

1.2.2腫瘤抗原的制備 SW111細胞培養(yǎng)于含10%FCS的IMDM培養(yǎng)基中,0.25%胰酶消化傳代。細胞呈指數(shù)期生長時,調細胞濃度1×107/ml,共計8.8 ml。放入液氮中10 min,室溫融化,反復5次。4℃離心,15 000 rpm,1 h。收上清。同時將細胞沉淀溶于8.8 ml生理鹽水中,超聲細胞破碎儀破碎30 min,4℃離心,15 000 rpm,1 h。收上清。兩次離心收獲的上清混合,-80℃保存?zhèn)溆?。用紫外分光光度儀測蛋白濃度。

1.2.3CpG-ODN刺激PBMC對腫瘤細胞的殺傷活性測定 調PBMC細胞濃度為6×106/ml,接種于24孔板,每孔500 μ l,每組2復孔。其中 PHA 10倍稀釋 ,每孔加 100 μ l?？乖?3 倍稀釋 ,每孔加 100 μ l。CpG-ODN 每孔 加 100 μ l,使其終 濃度 為 10 μ g/ml。IL-2每孔加10 μ l。各組分別補加相應體積的IMDM培養(yǎng)液至 1 000 μ l/孔 。37℃、5%CO2培養(yǎng) 72 h 備用。調SW1116細胞濃度為6×104/ml,接種于96孔培養(yǎng)板,100 μ l/孔。次日待細胞貼壁后加入上述準備好的效應細胞。效靶比50∶1。37℃、5%CO2培養(yǎng)72 h,在培養(yǎng)結束前4小時加入MTT(5mg/ml)20 μ l/孔。培養(yǎng)結束后離心棄上清,各孔加入150 μ lDMSO混勻,酶標儀492 nm波長測A值。

實驗分4組:(1)PBMC;(2)PBMC+Ag;(3)PBMC+Ag+IL-2;(4)PBMC+Ag+IL-2+CpG-ODN。

CTL活性計算:CTL活性={1-(實驗組A值-效應細胞對照組A值)/靶細胞對照組 A值}×100%。

1.3 統(tǒng)計學處理

應用SPSS11.0軟件行t檢驗。

2 結果

2.1CpG 2006、腫瘤抗原、IL-2共刺激可明顯提高PBMC的腫瘤殺傷活性,與單獨應用腫瘤抗原組及單獨應用IL-2組有顯著性差異(P＜0.01)。隨加入CpG濃度的增加,其腫瘤殺傷活性相應提高,呈線性相關。見表1,表2。

表1 CpG-ODN刺激PBMC對腫瘤細胞殺傷活性的測定(%,s,n=4,正常人組)

表1 CpG-ODN刺激PBMC對腫瘤細胞殺傷活性的測定(%,s,n=4,正常人組)

*與PBMC組相比,P＜0.01;**與不加CpG組相比,P＜0.01

組別 A值(s)PBMC 31.46±6.93 PBMC+Ag 36.04±7.57 PBMC+Ag+IL-2 46.61±0.60*PBMC+Ag+IL-2+CpG-ODN 77.86±0.58**

表2 CpG-ODN刺激PBMC對腫瘤細胞殺傷活性的測定(%,s,n=4,腫瘤組)

表2 CpG-ODN刺激PBMC對腫瘤細胞殺傷活性的測定(%,s,n=4,腫瘤組)

*與PBMC組相比,P＜0.01;**與不加抗原組相比,P＜0.05

組別 A值(s)PBMC 27.63±1.38 PBMC+Ag 33.59±0.72*PBMC+Ag+IL-2 47.54±1.67*PBMC+Ag+IL-2+CpG-ODN 77.71±1.60**

2.2正常人與腫瘤病人的PBMC均可被我們采用的不同干預手段激活。相同干預手段,各實驗組無明顯差異(P＞0.05)。見表3。

3 討論

近年來,我國結腸癌的發(fā)病率逐年增高[1]。目前的治療手段主要是以手術為主,輔以全身的放療和化療,但術后易復發(fā)和肝轉移。隨著免疫學的發(fā)展,人們對惡性腫瘤的免疫逃逸機制和機體的抗腫瘤免疫機制的認識不斷深入,免疫治療的作用越來越受重視[2]。有研究表明,腫瘤患者可通過免疫效應機制發(fā)揮抗腫瘤作用。當宿主免疫功能低下或受抑制時,腫瘤的發(fā)病率增高;而在腫瘤進行性生長時,患者的免疫功能也受到抑制[3]。我們實驗表明無論是正常人還是腫瘤病人的外周血淋巴細胞均可被凍融抗原、IL-2或CpGODN所激活而表現(xiàn)出較強的腫瘤殺傷活性。而凍融抗原、IL-2或CpGODN共同刺激組殺傷活性提高最為明顯,且與CpG濃度呈正相關,說明三者在免疫刺激機制上能夠協(xié)調、互補。用腫瘤凍融抗原進行主動免疫是一種比較理想的免疫治療方法。理論上應該可以激發(fā)全身細胞免疫功能,誘發(fā)長期免疫,但實際效果很難達到。IL-2是參與免疫應答的一種重要的細胞因子,可以促進T細胞增殖及產生細胞因子,促進B細胞增殖和分泌Ig,激活巨噬細胞,增強NK細胞的活化與增殖。CpG2006屬于B型CpGODN,能夠直接激活單核細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞,引起這些細胞分泌IL-12、TNF-α等Th1樣細胞因子,并刺激細胞表面分子MHC-Ⅱ 、B7-1、B7-2的表達 。除此之外,CpG2006還可以有效地激活獲得性免疫[4,5],在Th1細胞因子的作用下顯著增強獲得性細胞免疫。聯(lián)合應用凍融抗原、IL-2或CpGODN增強PBMC抗腫瘤作用可能的機制為:聯(lián)合刺激可以多途徑增強天然免疫,調節(jié)多種細胞因子的釋放,形成良好的免疫微環(huán)境;活化的腫瘤特異性淋巴細胞在微環(huán)境中進一步活化,激活其他免疫細胞或增強自身抗腫瘤免疫功能,使免疫原性較弱的腫瘤抗原能被免疫系統(tǒng)識別,誘導產生CTL并增強ADCC作用,有效地殺傷腫瘤細胞。

表3 CpG-ODN刺激PBMC對腫瘤細胞殺傷活性的測定(%,s,n=4)

表3 CpG-ODN刺激PBMC對腫瘤細胞殺傷活性的測定(%,s,n=4)

組別 腫瘤組 正常人組PBMC 27.63±1.38 31.46±6.93 PBMC+Ag 33.59±0.72 36.04±7.57 PBMC+Ag+IL-2 47.54±1.67 46.61±0.60 PBMC+Ag+IL-2+CpG-ODN 77.71±1.60 77.86±0.58

[1]《2008年我國衛(wèi)生事業(yè)發(fā)展統(tǒng)計公報》.中華人民共和國衛(wèi)生部.

[2]Hall SS.Acommotion in the blood:Life,death,and the immune system.Sloan Technology Seris[M].New York:Henry Holland Company,1997:538.

[3]Cerottini JC,Brunner KT.Cell-mediated cytotoxicity,allograft rejection,and tumor immunity[J].Adv Immunol,1974,18:67.

[4]Y Naito,K Saito,K Shiiba,et al.[J].Cancer Res,1998,58:3491.

[5]Krieg AM.CpG DNA induce sustained IL-12 expression in vivo and resistance to Listeria monocyto genes challenge[J].Immnol,1998,161:2428.