3-巰基丙酸自組裝金電極的制備及其對(duì)尿酸的電化學(xué)

宋宏圖，舒 好，汪召豪，萬其進(jìn)

(武漢工程大學(xué)綠色化工過程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北省新型反應(yīng)器與綠色化學(xué)工藝重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430074)

0 引 言

化學(xué)修飾電極是在傳統(tǒng)電化學(xué)電極基礎(chǔ)上發(fā)展起來的新研究方向，它是電化學(xué)和電分析化學(xué)的前沿研究領(lǐng)域[1].常規(guī)電化學(xué)電極材料簡(jiǎn)單、結(jié)構(gòu)單一、復(fù)合效應(yīng)差[2-4]，應(yīng)用上局限性極大.因此，近20年來化學(xué)修飾電極成為國(guó)際上電化學(xué)和分析化學(xué)家研究的熱點(diǎn)[5-6].化學(xué)修飾電極歸根結(jié)底是一種傳感器，是通過化學(xué)修飾的方法在電極表面進(jìn)行分子設(shè)計(jì)，將具有優(yōu)良化學(xué)性質(zhì)的分子、離子、聚合物固定在電極表面，造成某種微結(jié)構(gòu)，賦予電極某種特定的化學(xué)和電化學(xué)性質(zhì)，實(shí)現(xiàn)底物的表面電催化和電化學(xué)改性[7-9]，并廣泛地應(yīng)用于生物科學(xué)、環(huán)境科學(xué)、分析測(cè)試和能源等領(lǐng)域，在提高選擇性和靈敏度方面具有獨(dú)特的優(yōu)越性[10-13]；同時(shí)，通過對(duì)化學(xué)修飾電極的表征，進(jìn)一步揭示物質(zhì)的電荷傳遞規(guī)律和電極反應(yīng)動(dòng)力學(xué)[14]的本質(zhì)，豐富和發(fā)展了表面電化學(xué)和溶液電化學(xué)的基本理論和方法[15-17].

尿酸(UA)又稱為2，6，8-三氧嘌呤，是嘌呤的代謝最終產(chǎn)物，其中的嘌呤環(huán)沒有解開，其結(jié)構(gòu)如圖1所示.

正常情況下，人體內(nèi)的尿酸大約有1 200 mg，每天新生成約600 mg，同時(shí)排泄600 mg，處于平衡狀態(tài).但如果體內(nèi)產(chǎn)生過多來不及排泄或者尿酸排泄機(jī)制退化，則體內(nèi)尿酸潴留過多，當(dāng)血液尿酸質(zhì)量濃度大于7毫克/毫升，使人體體液變酸，影響人體細(xì)胞的正常功能，長(zhǎng)期置之不理將會(huì)引發(fā)痛風(fēng).隨著人們飲食結(jié)構(gòu)的改變，特別是富含蛋白質(zhì)和嘌呤食物攝入的增加，人群中尿酸水平逐年上升.事實(shí)上，近年來研究發(fā)現(xiàn)，血尿酸還與腎損害密切相關(guān)，并與老齡、高血壓、糖尿病等危險(xiǎn)因素一起使腎功能損害的患病率逐年增加.因此對(duì)其測(cè)定方法的研究在生理功能和臨床應(yīng)用方面都具有重要的實(shí)際意義[18].近年，測(cè)定尿酸的方法主要有酶法、伏安法、磷鎢酸還原法、毛細(xì)管電泳法、液相色譜法、同位素稀釋質(zhì)譜法和電化學(xué)法[19-21].

圖1 尿酸的結(jié)構(gòu)圖

20世紀(jì)30年代酶試劑用于臨床生化指標(biāo)測(cè)定，20世紀(jì)70年代得到了較大發(fā)展.臨床上常用的檢測(cè)尿酸的方法為單酶法，其基本原理是通過單一酶促反應(yīng)后利用各種方法測(cè)定底物或者產(chǎn)物的濃度來求待測(cè)物含量.該反應(yīng)利用磷酸鹽作為緩沖體系，在一定溫度下反應(yīng)一定時(shí)間，觀察吸光度值，通過計(jì)算可以得到尿酸的濃度值.此方法雖然操作簡(jiǎn)單，但操作過程太復(fù)雜[22-23].

伏安法是較常用的檢測(cè)尿酸的方法，近年來伏安法檢測(cè)尿酸在理論研究和實(shí)際運(yùn)用于臨床診斷上都取得了很大的發(fā)展.伏安法檢測(cè)尿酸常用的方法有以下兩種：一種是微電極示差脈沖伏安法.該方法是在電極表面修飾一層化學(xué)物質(zhì)分子，賦予電極特定的性質(zhì)，能有效地降低某些氧化還原物質(zhì)的過電位，從而達(dá)到分離或同時(shí)測(cè)定的目的.微電極示差脈沖伏安法常用的是聚甘氨酸修飾碳纖維微電極示差脈沖伏安法，利用碳纖維微電極(CFME)經(jīng)過特定的電化學(xué)方法活化，活化后的CFME表面修飾一層聚甘氨酸膜，該膜電極對(duì)尿酸有近可逆的響應(yīng).該方法測(cè)定結(jié)果較為準(zhǔn)確，可望用于在線檢測(cè)，但應(yīng)用不是十分廣泛.另外一種方法是吸附溶出伏安法.此法靈敏度高，有一定選擇性，是測(cè)定尿酸的新方法.該法抗干擾能力較強(qiáng)，操作簡(jiǎn)便，樣品處理簡(jiǎn)單，易于推廣.上述系列方法中，很多內(nèi)源物質(zhì)、外源物質(zhì)或者儀器本身對(duì)測(cè)量產(chǎn)生干擾.后來人們研究發(fā)展利用高效液相色譜測(cè)定血清中的尿酸.

Siekmann[24]將[1,3-15N2]尿酸標(biāo)記物加入血清樣品中，室溫下充分混合30 min，離子交換色譜進(jìn)行凈化，用乙酸將尿酸洗提出來，80 ℃氮?dú)獯蹈?，將殘留物用甲基氨溶解，再次吹?用N-甲基-N-三甲基硅烷基三氟乙酰胺進(jìn)行三甲基硅烷化衍生，最后用氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)進(jìn)行檢測(cè).并根據(jù)同位素稀釋法的原理計(jì)算血清中尿酸的含量.Ellerbe[25]等也研究采用[1,3-15N2]尿酸同位素標(biāo)記物作為內(nèi)標(biāo)，利用GC-ID/MS方法測(cè)定血清中的尿酸.在血清中加入[1,3-15N2]尿酸同位素標(biāo)記物，輕輕攪拌均勻，室溫下靜置一個(gè)晚上，充分平衡.平衡后的混合物經(jīng)陰離子交換色譜柱凈化，然后用乙酸洗提，所得尿酸溶液在60 ℃下用N-甲基-N-三甲硅烷基三氟乙酰胺進(jìn)行衍生化反應(yīng).然后用GC-MS分析.在GC-ID/MS分析中，需要采用樣品預(yù)處理手段，包括凈化、離子交換、衍生化等等.因此樣品的前處理過程比較復(fù)雜、費(fèi)時(shí)且成本較高.

Zhirl[26]等人采用反相液相色譜測(cè)定血清中的尿酸.Sakuma[27]等人討論了不同的樣品前處理方法對(duì)測(cè)定血清中尿酸含量的影響.SeKi[28]等人采用柱切換技術(shù)檢測(cè)血清中的尿酸.他們運(yùn)用了6種不同的柱子連接后對(duì)樣品進(jìn)行分離和定值.此方法的樣品前處理很簡(jiǎn)單，只需將血清稀釋和過濾，但是需要使用復(fù)雜的柱切換設(shè)備.Grune[29]等人用高效毛細(xì)管電泳法同時(shí)檢測(cè)了系列嘌呤堿和核酸.Xu[30]等人采用毛細(xì)管區(qū)帶電泳對(duì)血清中的尿酸進(jìn)行定性和定量.

于秀娟等[31]研究了細(xì)胞色素C在VB1自組裝膜修飾金電極上的電化學(xué)反應(yīng),有關(guān)化學(xué)修飾電極測(cè)定DA的方法已有報(bào)道[32-34].

本研究是利用電化學(xué)方法，通過尋找合適的修飾劑來制作電化學(xué)修飾電極.并以此為基礎(chǔ)，建立價(jià)格低廉、方便快捷、靈敏度高、線性范圍寬的測(cè)定UA的新型傳感器.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

CHI760B電化學(xué)工作站(上海辰華儀器公司)；三電極系統(tǒng)：金圓盤電極(Φ=2 mm)或修飾電極為工作電極，鉑絲電極為輔助電極，飽和甘汞電極(SCE)為參比電極；KQ250型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；Super NW超純水系統(tǒng)(Heal Force Development Co.,Ltd).

3-巰基丙酸(MPA),尿酸(UA)(Aladdin Chemistry Co.，Ltd)；磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液(pH=6.0)，利用Na2HPO4(0.2 mol/L)和檸檬酸(0.1 mol/L)配制而成；高純氮?dú)?武鋼氣體公司)；其它試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為超純水，溶液在使用之前均通N2除氧；實(shí)驗(yàn)在室溫下進(jìn)行.

2 結(jié)果與討論

2.1 MPA/Au電極的制備

將金電極(Au)于金相砂紙上磨光，用0.05 μmAl2O3粉末拋光成鏡面，依次在無水乙醇和二次水中超聲清洗各5 min，干燥備用.

將打磨好的金電極在0.5 mol/L的H2SO4中進(jìn)行循環(huán)伏安，以清洗電極表面上的雜質(zhì)，活化電極.然后浸泡在5 mmol/L的MPA溶液中進(jìn)行自組裝24 h.

2.2 MPA/Au電極的表征

2.2.1 MPA/Au電極在鐵氰化鉀溶液中的電化學(xué)行為 圖2為相同的條件下裸金電極(a)、MPA/Au電極(b)在0.005 mol/L的Fe(CN)63-/4-+0.1 mol/L KCl溶液中的循環(huán)伏安圖.比較圖中曲線(a)和曲線(b)可知，當(dāng)MPA自組裝到Au電極表面后，其在[Fe(CN)6]3-/4-溶液中的氧化還原峰電流減小，峰電位差加大，可逆性變差，這是由于MPA成功自組裝到電極表面后在一定程度上阻礙電子在金電極表面的傳遞.

圖2 在0.005 mol/L [Fe(CN)6]3-/4-+0.1 mol/L KCl中的循環(huán)伏安圖

注：(a)裸金電極，(b)3-巰基丙酸自組裝金電極；掃速100 mV/s.

2.2.2 MPA/Au電極的交流阻抗圖譜 交流阻抗法通過控制電化學(xué)系統(tǒng)的電流在小幅度的條件下隨時(shí)間按照正弦規(guī)律變化，直接或者間接的測(cè)量系統(tǒng)的電勢(shì)變化或者交流阻抗，進(jìn)而分析電化學(xué)系統(tǒng)的反應(yīng)機(jī)理、計(jì)算系統(tǒng)的相關(guān)參數(shù).結(jié)果如圖3所示，其中a和b分別代表裸金電極和MPA/Au電極在0.005 mol/L Fe(CN)63-/4-+0.1 mol/L KCl的溶液中的交流阻抗疊加圖.在含有探針分子[Fe(CN)6]4-/3-的情況下，復(fù)平面阻抗譜上的高頻部分是受動(dòng)力學(xué)控制的區(qū)域，低頻部分是受擴(kuò)散控制的區(qū)域.曲線a(裸電極)和b(修飾電極)，可以看到較之裸金電極而言，MPA/Au修飾電極在高頻部分出現(xiàn)一個(gè)直徑較大的圓弧，表明在高頻區(qū)修飾電極的電阻相對(duì)裸電極的電阻要大.這可以說明MPA修飾劑中含有一個(gè)—COOH，該基團(tuán)帶負(fù)電荷，阻礙電子在裸金電極表面的傳遞，這與不同電極在鐵氰化鉀中的循環(huán)伏安圖實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符合,進(jìn)一步表明MPA成功組裝到金電極表面.

圖3 分別為(a)裸金電極，(b)MPA/Au電極在0.005 mol/LFe(CN)63-/4+0.1 mol/L KCl溶液中的交流阻抗圖

2.2.3 MPA/Au在鐵氰化鉀溶液中峰電流與掃速的關(guān)系 本實(shí)驗(yàn)研究了在MPA/Au電極在在0.005 mol/L [Fe(CN)6]3-/4-+0.1 mol/L KCl溶液中的不同掃速對(duì)[Fe(CN)6]3-/4-氧化峰電流的影響.圖4是峰電流從小到大對(duì)應(yīng)的掃速,依次為20，40，60，80，100，120，140，160，180,200 mV/s.由圖5可知，在0.02～0.20 V/s的掃速范圍內(nèi)，[Fe(CN)6]3-/4-在MPA/Au電極上氧化峰電流與掃速的平方根成線性關(guān)系.經(jīng)分析其線性回歸方程為ip(μA)=2.693 6+3.365 3 v1/2(結(jié)果的單位為mV·s-1)，R=0.998 7.上式表明[Fe(CN)6]3-/4-在該電極上的氧化過程是受擴(kuò)散控制的.對(duì)于受擴(kuò)散控制過程的可逆氧化還原反應(yīng)的峰電流，可由Randles-Savcik方程表示(25 ℃時(shí))：

ip=2.69×105n3/2AD1/2v1/2c

式中ip為峰電流，單位為安培(A)；n為電子轉(zhuǎn)移數(shù)，A為電極的有效表面積，單位為cm2；D為反應(yīng)物的擴(kuò)散系數(shù)，單位為cm2/s；v為掃描速度，V/s；c為反應(yīng)物的濃度，mol/L.

由上式可知峰電流ip與v1/2應(yīng)該成直線關(guān)系，在一定條件下，如果已知反應(yīng)物的擴(kuò)散系數(shù)D，就可計(jì)算出電極的有效表面積A.在本實(shí)驗(yàn)中擴(kuò)散系數(shù)D可取6.7×10-6cm2/s，c為5×10-3mol/L，經(jīng)計(jì)算修飾電極的有效表面積為1.97×10-2cm2，而裸金電極的理論表面積為3.14×10-2cm2，比較可知金電極自組裝后有效表面積減小到為原來的62.6％，這是由于巰基雖然在電極表面形成一層致密的膜，修飾電極的有效總表面積仍然是減小的.

圖4 MPA/Au電極在0.005 mol/L [Fe(CN)6]3-/4-+0.1 mol/L KCl溶液中的循環(huán)伏安圖

注：掃速分別為：20，40，60，80，100，120，140，160，180，200 mV/s.

圖5 MPA/Au電極在0.005 mol/L [Fe(CN)6]3-/4-+0.1 mol/L KCl溶液中掃速的平方根與峰電流的線性關(guān)系圖

2.3 尿酸在MPA自組裝膜修飾金電極上的電化學(xué)行為及其測(cè)定

2.3.1 不同電極對(duì)UA的電化學(xué)響應(yīng) 圖6為不同修飾電極在pH=6.0Na2HPO4-C6H8O7緩沖溶液中的循環(huán)伏安圖：(a)MPA/Au電極對(duì)1×10-4mol/L UA的CV圖，(b)裸電極對(duì)1×10-4mol/L UA的CV圖，(c)裸電極在底液中的CV圖，(d)MPA /Au電極在底液中的CV圖.由曲線(b)可知UA在裸金電極上有一定的響應(yīng)，呈現(xiàn)一氧化峰；MPA自組裝到裸金電極表面后，如曲線(a)，氧化峰電流明顯增大，峰電位負(fù)移近200 mV，表明MPA組裝上電極表面后，對(duì)UA有非常良好的電催化作用.由曲線(d)可知，MPA/Au電極對(duì)底液沒有響應(yīng)，對(duì)比曲線(a)，可說明曲線(a)中的氧化峰為UA的氧化峰.

圖6 不同電極在Na2HPO4-C6H8O7緩沖溶液(pH=6.0)中的循環(huán)伏安圖

注：(a)MPA/Au電極在1×10-4mol/L UA中的CV圖，(b)裸電極在1×10-4mol/L UA中的CV圖，(c)裸電極在底液中的CV圖，(d)MPA/Au電極在底液中的CV圖.

2.3.2 底液的選擇 在定量分析UA過程中，模擬生物體內(nèi)環(huán)境使UA最大程度上保持生物活性，是保證測(cè)定結(jié)果正確性的必要條件，所以需要選擇最佳分析底液.本實(shí)驗(yàn)中，在選用不同底液時(shí)，pH值均為5.8，控制其它實(shí)驗(yàn)條件不變，將底液分別選為NaH2PO4-Na2HPO4緩沖溶液(c)，檸檬酸鈉-檸檬酸緩沖液(d)，Na2HPO4-C6H8O7緩沖液(a)，NaAc-HAc緩沖液(b)，然后測(cè)量UA標(biāo)準(zhǔn)溶液的CV圖，作峰電流與不同底液的曲線圖，如圖7，顯然在pH=5.8的Na2HPO4-C6H8O7緩沖液中，該修飾電極對(duì)UA的響應(yīng)峰電流最大，所以最終試驗(yàn)選擇Na2HPO4-C6H8O7緩沖液作為底液.

圖7 不同底液中UA的峰電流與底液的CV圖

2.3.3 最佳pH的選擇 該實(shí)驗(yàn)中，以Na2HPO4-C6H8O7緩沖溶液為底液，在pH5.0～7.0范圍內(nèi)配制改變1×10-3mol/L UA溶液，研究修飾電極在掃速為100 mV/s時(shí)的電化學(xué)行為隨pH值的變化情況.如圖8所示，在pH5.0～6.0范圍內(nèi)，峰電流隨著pH的升高迅速增大；當(dāng)pH超過6.0后，隨著pH的升高峰電流反而減小.故本實(shí)驗(yàn)選擇測(cè)定底液的pH為6.0.

圖8 不同pH(5.0～7.0)中1×10-3 mol/L UA的峰電流與pH的折線圖

2.3.4 自組裝時(shí)間的選擇 MPA分子幾乎呈平面長(zhǎng)鏈型，而且具有一個(gè)-SH，所以在自組裝過程中MPA很容易組裝到金電極的表面，快速地占據(jù)裸金電極表面的空白位點(diǎn)，形成一層致密的自組裝膜，在一定程度上會(huì)影響電子在電極表面的傳遞過程，從而影響電極的電化學(xué)性能.所以在試驗(yàn)中有必要探討最佳MPA(8 mmol/L)自組裝時(shí)間，使電極達(dá)到最佳電化學(xué)性質(zhì).控制其它試驗(yàn)條件不變，調(diào)整MPA自組裝時(shí)間分別為1 h(a)、2 h(b)、3 h(c)、6 h(d)、12 h(e)、18 h(f)、24 h(h)、30 h(g)，測(cè)量該電極在1×10-3mol/L UA標(biāo)準(zhǔn)溶液中的CV圖，如圖9可知，24 h是最佳自組裝時(shí)間.

圖9 修飾電極在MPA(8 mmol/L)溶液中不同組裝時(shí)間對(duì)UA的CV圖

注：1 h(a)、2 h(b)、3 h(c)、6 h(d)、12 h(e)、18 h(f)、24 h(h)、30 h(g).

2.3.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 如圖10，在pH=6.0的Na2HPO4-C6H8O7緩沖溶液中，利用示差脈沖技術(shù)測(cè)量濃度在1.6×10-4～1×10-6mol/L范圍內(nèi)UA標(biāo)準(zhǔn)溶液的電化學(xué)響應(yīng)，電位掃描范圍0.0～0.8 V，掃速為100 mV/s.由圖10可知，UA響應(yīng)峰電流隨著濃度的增大而呈線性增加，峰電位基本保持不變.

如圖11，是UA氧化峰電流與UA濃度的線性關(guān)系曲線，線性方程為ip(μA)=0.738 9+0.040 46 c0/(μmol/L)，相關(guān)系數(shù)R=0.998 6，檢測(cè)限為5×10-7mol/L，這一結(jié)論說明MPA/Au電極在濃度范圍為1.6×10-4～1×10-6mol/L內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，可以將其應(yīng)用于實(shí)際UA試樣溶液的濃度定量分析.

2.3.6 MPA/Au修飾電極的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性 在本實(shí)驗(yàn)中，使用MPA/Au電極平行測(cè)定1.2×10-4mol/L的UA溶液20次，如圖12所示，從第二次之后峰電流基本穩(wěn)定，由此可以說明體系的重現(xiàn)性良好.然后，對(duì)比新制備的MPA/Au電極，用在二次蒸餾水中放置一周后的電極測(cè)定同一濃度的UA溶液，其峰電流無明顯變化，表明MPA/Au電極具有較長(zhǎng)的使用壽命和良好的穩(wěn)定性，可以用于UA的分析測(cè)定.

圖10 MPA/Au電極在底液為pH=6.0的Na2HPO4-C6H8O7緩沖溶液的UA溶液中的示差脈沖曲線圖

注：由上到下濃度分別為1.6×10-4，1.4×10-4，1.2×10-4，9×10-5，7×10-5，6×10-5，5×10-5，3×10-5，1×10-6mol/L；掃速100 mV/s；pH=6.0.

圖11 峰電流與UA濃度的線性相關(guān)曲線

圖12 MPA/Au修飾電極的穩(wěn)定性

3 結(jié) 語

本研究以裸金電極為基體電極，以3-巰基丙酸為修飾劑，運(yùn)用自組裝的方法，制備3-巰基丙酸自組裝修飾電極(MPA/Au).相比伏安法測(cè)定尿酸(檢測(cè)限一般在1×10-7mol/L左右)，MPA/Au電極能夠更迅速，準(zhǔn)確，簡(jiǎn)便地測(cè)量UA.

提高靈敏度和選擇性一直是各種分析方法長(zhǎng)期以來所追求的目標(biāo)，可以利用不同修飾劑的混合自組裝方法和電沉積納米金方法來提高修飾電極的靈敏度和選擇性.MPA/Au修飾電極作為一種新型的化學(xué)傳感器，由于其特有的穩(wěn)定性，高靈敏性以及巨大的潛在應(yīng)用價(jià)值，一定會(huì)得到越來越多人的關(guān)注.

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