食線蟲真菌的篩選及菌株DF09002的鑒定與產(chǎn)酶特性分析

曾慶飛, 黃惠琴, 朱 軍, 方 哲, 吳曉鵬, 孫前光, 鮑時翔*

(1.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所,?？?571101; 2.海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院,?？?570228)

根結(jié)線蟲(Meloidogyne spp.)是線蟲中一類分布廣、危害大、難以防治的植物寄生線蟲,多數(shù)種類寄主范圍廣、致病性強(qiáng),而且繁殖快、易于傳播擴(kuò)散,已成為世界性威脅農(nóng)作物生產(chǎn)的最重要的病原物類群之一,由根結(jié)線蟲為害植物根系引起的土傳病害已上升為世界性的重要農(nóng)作物病害[1-2]。我國熱帶、亞熱帶地區(qū)的省份及寒帶溫室蔬菜都有根結(jié)線蟲發(fā)生,一般造成減產(chǎn)10%～20%,嚴(yán)重時減產(chǎn)達(dá)70%以上[3]。根結(jié)線蟲的防治方法目前仍以化學(xué)防治為主,但化學(xué)藥劑廣泛使用所帶來的環(huán)境污染等一系列副作用已日趨凸顯,生產(chǎn)應(yīng)用正逐步受到限制,研究符合現(xiàn)代農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展戰(zhàn)略理念的生物防治方法已顯得十分重要和迫切[4]。

在線蟲生防資源中,食線蟲真菌是一類能寄生、捕捉、定殖或毒殺線蟲的微生物,是自然界中控制、平衡和調(diào)節(jié)線蟲種群數(shù)量的重要生物因子,在植物病原昆蟲和線蟲的生物防治中起著非常重要的作用[5]。目前已開發(fā)的商品化生防制劑為數(shù)不多,而且存在防效偏低或防效不穩(wěn)定等問題[6],不斷篩選在自然土壤條件下對寄生線蟲毒力更強(qiáng)的生防菌株具有十分重要的意義。本課題組從海南五指山原始森林、定安雷鳴根結(jié)線蟲發(fā)病胡椒園采集土壤樣品及死亡線蟲尸體,從中分離篩選獲得一批具有抗根結(jié)線蟲活性的真菌,本文報道了菌株分離、篩選、分類鑒定及其酶系分析的研究結(jié)果。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

從海南五指山原始森林采集土壤樣品,從定安雷鳴等地的根結(jié)線蟲發(fā)病胡椒園采集根際土樣及死亡線蟲尸體。

1.2 培養(yǎng)基

①真菌分離及分類鑒定培養(yǎng)基：采用PDA培養(yǎng)基,滅菌冷卻后加入雙抗(青霉素100 U/mL、鏈霉素100 U/mL);②發(fā)酵培養(yǎng)基：20%土豆汁1 000 mL,葡萄糖20 g,pH自然;③剛果紅羧甲基纖維素鈉(CMCNa)瓊脂培養(yǎng)基：(NH4)2SO40.2%,MgSO4?7H2O 0.05%,KH2PO40.1%,NaCl 0.05%,CMC-Na 2%,剛果紅0.02%,瓊脂2%,pH7.2;④酪蛋白培養(yǎng)基：干酪素1%,瓊脂2%;⑤膠態(tài)幾丁質(zhì)培養(yǎng)基：K2HPO4 0.07%,KH2PO40.03%,MgSO4?7H2O 0.05%,FeSO4?7H2O 0.002%,ZnSO40.001%,NaCl 0.45%,1%(W/V)膠態(tài)幾丁質(zhì)15%(V/V),胰蛋白胨0.2%,瓊脂1.8%,pH7.0。

1.3 供試線蟲

南方根結(jié)線蟲(M.incognita)采自番茄根結(jié)線蟲病根,用本室發(fā)明的離體方法人工培養(yǎng)(另文發(fā)表)。

1.4 真菌分離與待測樣品的制備

將土壤及線蟲尸體樣品經(jīng)處理制成的水懸液分別稀釋,涂布于分離培養(yǎng)基平板,28℃倒置培養(yǎng)2～5 d。通過肉眼觀察菌落的不同,挑取單菌落純化、保存。將活性菌株接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中,28℃、200 r/min培養(yǎng)6 d,離心發(fā)酵液,取上清,備活性檢測用。

1.5 抗線蟲活性測定

采用菌體-線蟲篩選法。取部分離體培養(yǎng)處于繁殖旺盛期的南方根結(jié)線蟲,連同培養(yǎng)基轉(zhuǎn)入純化培養(yǎng)已長滿菌絲并剛開始產(chǎn)孢的待測真菌平板,輕輕涂布,28℃培養(yǎng)箱內(nèi)靜置,24 h后定期刮取板內(nèi)線蟲,24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中蒸餾水稀釋后倒置顯微鏡下觀察死亡情況,以轉(zhuǎn)入無菌PDA平板中的培養(yǎng)線蟲為對照,計算校正死亡率;將活菌絲對線蟲的致死率達(dá)70%以上的菌株發(fā)酵培養(yǎng),24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中分別加入1 mL發(fā)酵液和約200條經(jīng)過濾分離的培養(yǎng)線蟲,混勻,28℃靜置24 h后倒置顯微鏡下觀察,以無菌空白發(fā)酵培養(yǎng)基處理作對照,每處理重復(fù)3次,計算線蟲校正死亡率。

1.6 菌株鑒定

1.6.1 形態(tài)學(xué)鑒定

參照文獻(xiàn)[7],采用平皿插片法進(jìn)行菌株的培養(yǎng)及形態(tài)特征的觀察。

1.6.2 分子鑒定

1.6.2.1 DNA的提取

參照文獻(xiàn)[8]提取菌株的基因組DNA。

1.6.2.2 PCR擴(kuò)增

采用ITS序列通用引物(上海生工合成),ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC;ITS5：GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG 。50 μ L 反應(yīng) 體積 ：10 ×Buffer 5 μ L,dNTPs(各 2.5 mmol/L)4 μ L,10 μ mol/L 引物各 2 μ L,Taq 酶 0.25 μ L,模板 DNA 1 μ L,無菌ddH2O 35.75 μ L 。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性2 min;95℃變性1 min,54℃退火1 min,72℃延伸1.5 min,35個循環(huán);72℃延伸10 min,4℃保存。取5 μ L PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳檢測,其余產(chǎn)物經(jīng)純化后送上海生物工程有限公司測序。

1.7 酶系分析

1.7.1 產(chǎn)酶種類鑒定

無菌條件下用打孔器分別在CMC-Na瓊脂平板、酪蛋白平板以及膠態(tài)幾丁質(zhì)平板上打孔,加入制備好的菌株發(fā)酵液,28℃靜置12 h后觀察透明圈的形成。

1.7.2 酶活測定

1.7.2.1 幾丁質(zhì)酶活測定

采用DNS(3,5-二硝基水楊酸)測定還原糖的方法測定幾丁質(zhì)酶活。先將培養(yǎng)液用濾紙過濾,取4支試管,分別加入0.5 mL濾液(粗酶液)和0.5 mL 1%幾丁質(zhì)膠體,其中3支試管于40℃水浴60 min,另外1支4℃放置作為對照;水浴60 min后在樣品和對照中各加入0.5 mL DNS,沸水浴10 min;加入4.5 mL蒸餾水,離心取上清液于540 nm測量吸光度。還原糖含量以葡萄糖作標(biāo)準(zhǔn)曲線計算。酶活力單位(U)以在上述反應(yīng)條件下1 min產(chǎn)生1 μ mol還原糖所需的酶量計算。

1.7.2.2 蛋白酶活力測定

采用福林-酚試劑法測定蛋白酶活力。取1%酪蛋白0.5 mL和粗酶液1 mL,40℃水浴10 min,加入0.4 mol/L三氯乙酸3 mL終止反應(yīng),3 000 r/min離心3 min,取上清1 mL,加入5 mL 0.4 mol/L Na2CO3和0.5 mL福林-酚試劑,40℃水浴20 min后在650 nm下測定吸光值。在上述條件下1 h由底物產(chǎn)生1 μ mol酪氨酸所需的酶量為一個酶活單位(U)。

2 結(jié)果與分析

2.1 真菌的分離與篩選結(jié)果

在27份樣品中共分離到126株菌落形態(tài)有差異的真菌。通過菌體-線蟲篩選模型,獲得7株菌絲體對線蟲具有較強(qiáng)致死作用(校正死亡率在70%以上)的菌株,占供試菌株的5.6%。其中菌株DF09002的殺蟲活性最強(qiáng),校正死亡率達(dá)95.3%,且死亡蟲體及卵粒體壁全部變得透明、體內(nèi)組織呈裂解狀(圖1a)。用24孔板線蟲液篩選模型進(jìn)一步篩選,發(fā)現(xiàn)也是菌株DF09002的發(fā)酵液活性最高,24 h內(nèi)能將供試線蟲全部殺滅,稀釋5倍后校正擊倒率仍達(dá)68.5%,死亡蟲體依然呈透明裂解狀(圖1b)。對其產(chǎn)生殺線蟲活性物質(zhì)的遺傳穩(wěn)定性進(jìn)行試驗(yàn),結(jié)果表明,連續(xù)5代的菌絲體及發(fā)酵液對根結(jié)線蟲的致死效果保持穩(wěn)定。因此選取分離自定安雷鳴胡椒根際土樣中的菌株DF09002作為研究對象。

圖 1 菌株DF09002菌絲體致死線蟲特征(150×)

2.2 菌株DF09002的鑒定結(jié)果

2.2.1 形態(tài)和培養(yǎng)特征

菌落形態(tài)：在PDA培養(yǎng)基上菌落為絨毛狀,初生時白色,3 d后逐漸變成棕、黑色,反面乳白色。28℃下生長7 d直徑可達(dá)4.0～5.0 cm。菌絲、分生孢子梗和孢子形態(tài)：顯微鏡下可見不分支的孢子梗,從營養(yǎng)菌絲的厚壁細(xì)胞上著生出來,孢子梗頂端圓形,孢子布滿于孢子梗頂端的整個膨大部分,聚集成球狀分生孢子頭,分生孢子呈球形或橢圓形,分生孢子壁光滑;菌絲體透明,分支繁復(fù),有隔膜。

根據(jù)形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果,參閱文獻(xiàn)[9],該菌株的形態(tài)特征與子囊菌綱、真子囊亞綱、散囊菌目、散囊菌科、曲霉屬的黑曲霉符合,初步鑒定為黑曲霉(Aspergullus niger)。

2.2.2 菌株分子鑒定結(jié)果

對菌株DF09002的 rDNA-ITS擴(kuò)增獲得了約600 bp的序列(GenBank注冊號GU338398),將該序列在GenBank中進(jìn)行同源性比對,發(fā)現(xiàn)與黑曲霉和塔賓曲霉的同源性均達(dá) 99%。選擇與菌株DF09002同源性高的8個序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析,結(jié)果如圖2所示。結(jié)合形態(tài)培養(yǎng)特征,將其歸類為曲霉屬黑色組曲霉黑曲霉集合體,命名為Aspergillus niger DF09002。

圖2 基于ITS的菌株DF09002與相關(guān)菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 菌株DF09002的產(chǎn)酶特性

2.3.1 酶系分析及酶活測定結(jié)果

菌株DF09002的發(fā)酵液在剛果紅CMC-Na瓊脂培養(yǎng)基上不產(chǎn)生透明圈,在膠態(tài)幾丁質(zhì)和酪蛋白平板上產(chǎn)生了明顯透明圈(圖 3、圖 4),表明菌株DF09002在該培養(yǎng)條件下能產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶和胞外蛋白酶,不產(chǎn)生纖維素酶。幾丁質(zhì)酶和蛋白酶的酶活測定結(jié)果分別為0.67、41.63 U/mL。

2.3.2 粗酶液反應(yīng)最適溫度

設(shè)置不同水浴溫度檢測酶活,結(jié)果表明幾丁質(zhì)酶反應(yīng)的最適溫度為40℃,蛋白酶的最適反應(yīng)溫度 為55℃(圖5)。

圖5 溫度對粗酶液酶活力的影響

2.3.3 粗酶液反應(yīng)最適pH

以檸檬酸緩沖液(pH2.5～6.5)以及磷酸緩沖液(pH6.5～8.0)稀釋10%幾丁質(zhì)膠體至1%,成為濃度梯度幾丁質(zhì)膠體底物,測得粗酶液中幾丁質(zhì)酶的最適反應(yīng)pH為6.8;用不同pH的混合緩沖液(pH2.5～11.0)調(diào)節(jié)底物酪蛋白的pH,測得粗酶液中蛋白酶的最適反應(yīng)pH為9.0(圖6)。

圖6 pH對粗酶液酶活力的影響

產(chǎn)酶特性試驗(yàn)結(jié)果顯示,菌株DF09002具有較強(qiáng)的幾丁質(zhì)酶活性,而且與多數(shù)幾丁質(zhì)酶不同的是,該幾丁質(zhì)酶的最適作用pH不在酸性區(qū),而是在接近中性的環(huán)境中。蛋白酶的最適作用pH在堿性范圍內(nèi),推測可能為絲氨酸類蛋白酶。

3 討論

本研究中,利用本室發(fā)明的根結(jié)線蟲離體培養(yǎng)技術(shù),采用真菌菌絲與培養(yǎng)基中生長繁殖線蟲直接接觸的篩選方法,目的是希望能發(fā)現(xiàn)以寄生或毒殺方式作用于線蟲的菌株;對活性菌株的發(fā)酵培養(yǎng)選用馬鈴薯培養(yǎng)液,是出于該培養(yǎng)液對線蟲活性無影響的考慮。本文篩出的活性菌株DF09002是以毒殺方式侵染線蟲的,其產(chǎn)孢初期的菌絲體對半固體培養(yǎng)基中的根結(jié)線蟲即具有較強(qiáng)的抑殺作用,而發(fā)酵原液對培養(yǎng)蟲體的校正死亡率高達(dá)100%,且死亡線蟲均呈透明裂解狀。在檢測的胞外酶種類中,菌株具有較強(qiáng)的幾丁質(zhì)酶和堿性蛋白酶活力,顯示它們是DF09002的重要毒力因子之一。

根據(jù)形態(tài)培養(yǎng)和 ITS序列鑒定結(jié)果,將菌株DF09002歸類為曲霉屬黑色組曲霉黑曲霉集合體,與黑曲霉和塔賓曲霉的同源性均達(dá)99%。黑曲霉是一種在發(fā)酵工業(yè)中用途較廣的多種活性酶系的產(chǎn)生菌,據(jù)報道部分菌株具有線蟲拮抗活性。1903年Metcalf首次描述了小桿線蟲上黑色的曲霉屬真菌對其有致死作用[10],后來Mankau報道黑曲霉的培養(yǎng)濾液對燕麥真滑刃線蟲有活性[11]。1994年Zuckerman報道了黑曲霉菌株P(guān)D242的發(fā)酵液中主要?dú)⒕€蟲物質(zhì)為檸檬酸和草酸,還有分子量大于8000MW的一種未測定物質(zhì)[12]。國內(nèi)朱曉峰等報道黑曲霉菌株Snf009的發(fā)酵液對南方根結(jié)線蟲2齡幼蟲具有抑制作用,并測出以草酸為主的有機(jī)酸是主要的線蟲拮抗因子[13]。塔賓曲霉中的一些菌株因高產(chǎn)果膠酶而在固態(tài)發(fā)酵中應(yīng)用較多,是一種可供利用的糖化菌[14]。HeC,FanY等報道塔賓曲霉菌株NJA-1能高效降解脫氧雪腐鐮刀菌烯醇毒素(DON),而且發(fā)現(xiàn)是菌株中的一種未知化合物在DON的生物轉(zhuǎn)化過程中起重要作用[15]。但未見塔賓曲霉中有線蟲拮抗菌株的報道。

本文中的活性菌株DF09002在產(chǎn)孢初期的菌絲體以及菌體發(fā)酵液對線蟲及卵粒體壁都有穿透分解作用,在這一侵染毒殺過程中,除幾丁質(zhì)酶和堿性蛋白酶外,可能還存在有機(jī)酸等類代謝物的共同作用。下步研究將集中在抗蟲活性物質(zhì)的系統(tǒng)鑒定上,并對菌株的線蟲毒殺機(jī)理作出綜合探討。

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