灰飛虱酵母雙雜交cDNA文庫的構建及分析

肖冬來, 鄧慧穎, 謝荔巖, 吳祖建, 謝聯(lián)輝

(福建農(nóng)林大學植物病毒研究所,福建省植物病毒學重點實驗室,福州 350002)

灰飛虱(Laodelphax striatellus Fallen)不僅是禾本科作物的重要害蟲,也是一些病毒病的傳毒介體。目前已知灰飛虱可傳播的病毒有水稻條紋病毒(Rice stripe virus,RSV)、水稻黑條矮縮病毒(Rice blackstreaked dwarf virus,RBSDV)。近年來,由于水稻種植品種、耕作制度、暖冬氣候等原因造成了灰飛虱數(shù)量逐年增加[1]。2004-2005年,江蘇省RSV每年發(fā)病面積達170萬hm2[2],2008年江蘇一些地區(qū)的黑條矮縮病平均發(fā)病率達到54.6%,發(fā)病植株幾近絕收,并有逐步蔓延加重的趨勢[3]。近年來,對這兩種病毒的分子生物學研究取得了一些進展,病毒編碼的一些基因功能得到了鑒定[4-6],但關于病毒與寄主互作方面的研究還比較少,尤其是病毒與介體昆蟲之間的互作。

構建cDNA文庫是研究功能基因組學的主要手段之一,通過構建酵母雙雜交cDNA文庫,以某個蛋白為誘餌篩選cDNA文庫對大規(guī)模研究蛋白間的互作有著重要的意義。本研究以灰飛虱mRNA為模板,利用Gateway技術構建了初級灰飛虱cDNA文庫,并將其轉換到載體pDEST22中,構建了高質(zhì)量的酵母雙雜交cDNA文庫,為下一步研究灰飛虱與其傳播的病毒間的互作奠定了基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料

灰飛虱采自江蘇水稻田間,經(jīng)斑點免疫雜交和PCR檢測不攜帶水稻條紋病毒,其后代飼養(yǎng)于臺中本地1號品種幼苗上,室溫保持在25～28℃,每4 d更換1次水稻幼苗,適時澆水。

1.1.2 主要試劑

T rizol、FastTrack·2.0 Kit、CloneMinerTMcDNA Library Construction Kit、ProQuestTMTwo-Hybrid System、PureLinkTMHiPure Plasmid DNA Midi Purification Kits均購自Invitrogen公司,T4 DNA Ligase均購自NEB公司。

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取

稱取灰飛虱1～2 g,在液氮中研磨后,用Trizol試劑提取組織總RNA(具體操作參考說明書),并用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計進行檢測和質(zhì)量分析。

1.2.2 mRNA的分離純化

利用FastT rack·2.0 Kit對提取的灰飛虱總RNA分離純化mRNA(具體操作按參考說明書),利用紫外分光光度計檢測mRNA的質(zhì)量。

1.2.3 cDNA的合成

按照CloneMinerTMcDNA Library Construction Kit的操作手冊進行：取 2 μ g mRNA 為模板,加 DEPC-treated water 至 9 μ L,再 加 入 BiotinattB2-Oligo(dT)primer、10 mmol/L dNTPs 各1 μ L,混勻,于65 ℃孵育5 min后45 ℃冷卻2 min,加入事先混合好的5×First Strand Buffer 4 mL,0.1 mol/L DTT 2 μ L,DEPC-treated water 1 μ L,45 ℃2 min;最后 加 入 2 μ L SuperScriptTMII RT 2 mL,混勻,45℃孵育60 min合成第1鏈cDNA;向合成好的第 1鏈中加入 92 μ L DDW,30 μ L 5×Second Strand Buffer,10 mmol/L dNTPs 3 μ L,E.coli DNA Ligase 1 μ L,E.coli DNA 聚合酶 I 4 μ L,E.coli RNaseH 1 μ L,16 ℃ 2 h 后加入 2 μ L T4 DNA聚合酶,混勻,16℃2 min后終止反應;酚氯仿抽提、乙醇沉淀后與attB1接頭連接,在50 μ L連接體系中加入 18 μ L 新合成的雙鏈 cDNA,10 μ L 5×Adapter buffer,10 μ L attB1(1 μ g/μ L),0.1 mol/L DDT 7 μ L,5U T4 DNA連接酶,16℃連接過夜。將帶有attB接頭的cDNA通過BP反應構建到pDONR222載體上。

1.2.4 初級cDNA文庫總克隆數(shù)CFU的鑒定

將插入cDNA的pDONR222載體轉化ElectroMAXTMDH10BTMT1 Phage Resistant感受態(tài)細胞,37℃250 r/min復蘇1 h后保存于含40%甘油的SOC液體培養(yǎng)基中,-80℃保存。取轉化后的細菌原液(2 mL)10 μ L稀釋 1 000倍后,從中取出50 μ L 涂布 LB 平板(含 50 μ g/mL Kan),37 ℃倒置培養(yǎng)過夜,總克隆數(shù)按照CFU=平板上的平均克隆數(shù)×稀釋倍數(shù)×103/涂布體積(μ L)×2計算。

1.2.5 初級文庫平均插入片段及重組率鑒定

隨機挑取在平板上生長的單克隆,以pDONR222載體上的通用引物M13F和M13R進行菌液PCR,檢測插入片段的大小。

1.2.6 初級文庫pDONR222質(zhì)粒提取

取3×106個克隆,接種于50 mL肉湯培養(yǎng)基(牛肉膏0.3 g,蛋白胨1.0 g,NaCl 0.5 g,水 100 mL,pH 7.0～7.2)中,37℃,275 r/min振蕩,當吸光度到達A600約0.6,細胞的濃度大約是 1.5×1010cells/mL(1 A600≈2.5×1010cells/mL)時,停止振蕩培養(yǎng)。按照PureLinkTMHiPure Plasmid DNA Midi Purification Kits的方法提取pDONR222文庫質(zhì)粒。

1.2.7 酵母雙雜交文庫構建及擴增

構建完成初級文庫并對文庫質(zhì)量初步鑒定后,通過LR反應將文庫cDNA從pDONR222載體轉換到酵母表達載體pDEST22上,反應體系如下：pDONR222 文庫 質(zhì)粒 N μ L(300 ng)、pDEST22(150 ng/μ L)3 μ L 、5 ×LR Clonase Reaction Buffer 4 μ L 、LR Clonase 6 μ L,加 T E 至 總 體積 20 μ L,25℃反應20 h;乙醇沉淀 LR重組產(chǎn)物,重懸在9 μ L TE中,利用電轉法轉化大腸桿菌DH10B細胞,加入2 mL SOC液體培養(yǎng)基,37℃復蘇1 h,轉化液用SOC液體培養(yǎng)基稀釋10倍后全部涂于100塊15 cm 的LB平板(含100 μ g/mL Amp),37℃倒置培養(yǎng)過夜,無菌操作刮下菌苔,懸浮于20%甘油保存液中,分裝后-80℃保存,此即為擴增文庫。

1.2.8 擴增文庫滴度的鑒定

取10 μ L擴增文庫的原液,進行10倍連續(xù)梯度稀釋,將每個稀釋梯度取100 μ L涂布LB平板(含100 μ g/mL Amp),37 ℃倒置培養(yǎng)過夜,計算每個梯度平板上生長的平均菌落數(shù)量。按照公式：文庫滴度=平板上的克隆數(shù)×稀釋倍數(shù)×103/涂布體積(μ L)計算 。

1.2.9 擴增文庫平均插入片段及重組率鑒定

方法同1.2.5,采用pDEST22上的通用引物進行擴增。

1.2.10 cDNA插入片段測序分析

隨機挑取cDNA文庫中10個克隆進行測序,測序結果通過GenBank中的Blast功能進行比對,尋找相似序列。

2 結果與分析

2.1 灰飛虱總RNA的提取及mRNA的分離

提取的灰飛虱總RNA經(jīng)紫外分光光度計測定分析 ,A260/A280=1.983,濃度為 2.11 μ g/μ L 。 取少量RNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測,結果顯示所提取的總 RNA 28S和18S清晰、完整(圖 1),表示RNA未降解,質(zhì)量高,純化的mRNA較清晰,大小分布均勻,可用于下步文庫的構建。

2.2 初級cDNA文庫質(zhì)量的檢測

根據(jù)1.2.4中的總克隆數(shù)計算公式得出初級cDNA文庫的庫容量為1.85×107cfu。從平板上隨機挑取32個轉化子菌落,通過菌液PCR檢測插入片段及重組率。從圖2可以看出,灰飛虱初級文庫cDNA插入片段主要分布在1 000～2 000 bp之間,平均插入片段大于 1 300 bp,具有良好的多態(tài)性。在所檢測的32個轉化子中有1個為空載體,根據(jù)公式：文庫重組率=(有插入片段的轉化子/總轉化子)×100%,計算出文庫的重組率約為97%。

圖1 總RNA和mRNA瓊脂糖凝膠電泳圖

圖2 灰飛虱初級cDNA文庫插入片段的PCR檢測

2.3 擴增文庫質(zhì)量的檢測

根據(jù)1.2.8中的文庫滴度計算公式,計算得出擴增文庫的滴度為7.7×108cfu/mL,總庫容量為1.5×109cfu。從平板上隨機挑取 34個克隆進行菌液PCR鑒定,從圖3中可以看出擴增文庫的插入片段主要集中在1 000～1 500 bp之間,具有較好的多態(tài)性。34個克隆中有1個為空載體,所以擴增文庫的重組率約為97%。較高的文庫滴度、庫容量和重組率保證了文庫的完整性和覆蓋度。

圖3 灰飛虱酵母雙雜交cDNA文庫插入片段的PCR檢測

2.4 cDNA插入片段測序分析

通過對隨機挑取的10個克隆進行測序,結果在GenBank數(shù)據(jù)庫中進行Blast比對后分析得知,10個克隆中有7個可以在數(shù)據(jù)庫中找到高度同源的序列,其中L2、L7在插入時所編碼的蛋白與已知的蛋白讀碼一致,沒有發(fā)生移碼。

表1 文庫質(zhì)粒cDNA插入片段序列比對分析

3 討論

一個高質(zhì)量的cDNA文庫不僅要有高的代表性,也要能保證所插入cDNA片段的完整性,所以從RNA的提取到mRNA的純化過程都必須嚴格操作,避免RNA的降解,這是保證所構建文庫具有高庫容量的先決條件。試驗中所提取的灰飛虱總RNA質(zhì)量高,純化的mRNA大都分布在1～12 kb之間,達到了文庫構建的要求。一個真核生物細胞中約有5×105個mRNA拷貝,扣除操作誤差和系統(tǒng)誤差,所構建的cDNA文庫至少應具有1×106cfu的庫容量[7]。Invitrogen公司的酵母雙雜交文庫構建系統(tǒng)采用了Gateway技術,該技術位點特異性重組構建載體,且通過ccdB基因來篩選陽性克隆,這不僅提高了操作的便捷性、高效性,也提高了陽性克隆率。通過對構建的灰飛虱cDNA文庫的分析表明,初始文庫的庫容量為1.85×107,從而保證了文庫的覆蓋度。由于采用的是在cDNA兩端分別加上attB1和attB2接頭進行位點特異性重組構建載體,保證了能夠定向重組進載體,也避免了限制性酶切和連接的過程,從而保證了插入的cDNA片段的方向和序列完整性,同時也降低了嵌合克隆出現(xiàn)的幾率[8],大大提高了文庫構建的質(zhì)量。有研究表明插入片段在mRNA中的位置是有一定傾向性的,其位于基因5′端和3′端的比例約為69%和29%[9],5′端的非編碼區(qū)往往帶有終止密碼子,這就阻礙了插入片段在酵母中的正確表達,在對灰飛虱文庫隨機挑取的10個克隆進行測序分析中發(fā)現(xiàn)能夠在酵母中正常表達蛋白沒有很快提前終止的有3個,而表達的蛋白能夠比對到具有較高同源性的只有2個(L2、L7)。為了克服由于插入片段中非編碼區(qū)帶有終止密碼子造成的提前蛋白翻譯終止,Invitrogen公司還提供了3閱讀框構建文庫的技術,其原理是通過引入3個不同接頭,使得插入片段能夠包含3種不同的讀碼方式,從而進一步保證了文庫篩選的完整性。

目前只有少數(shù)幾種昆蟲已經(jīng)完成了全基因組測序,且在GenBank數(shù)據(jù)庫中已報道的灰飛虱基因也很少,隨機挑取的10個克隆中有3個沒有比對出具有較高同源性的序列,在其他8個克隆中,L2和L9與已經(jīng)發(fā)布的兩條灰飛虱序列具有較高同源性,分別為灰飛虱細胞色素氧化酶亞基II、灰飛虱alpha 1微管蛋白。利用該灰飛虱 cDNA文庫,通過直接PCR,我們已經(jīng)成功克隆了一些與昆蟲核糖體蛋白L40同源的灰飛虱基因(未發(fā)表結果)。更多的灰飛虱基因的克隆乃至全基因組測序?qū)媒湍鸽p雜交技術研究一些基因與灰飛虱的互作將起到重要的作用。

通過cDNA文庫可篩選一些目的基因,對于非模式物種來說是一種具有重要意義的有效手段[10]。酵母雙雜交系統(tǒng)具有快速、靈敏的特點,已被廣泛用來研究蛋白間的互作。在植物病毒與昆蟲介體的互作研究中也有報道[11-12]。本試驗中構建的灰飛虱酵母雙雜交文庫具有較高的完整性和覆蓋度,達到了酵母雙雜交篩選的標準,可以用來研究RSV、RBSDV與介體灰飛虱間互作,以這兩種病毒的功能蛋白為誘餌篩選與之互作的灰飛虱蛋白,以便更深入了解昆蟲介體傳毒機制。

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