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    UPS抑制劑對(duì)成年大鼠腦內(nèi)淀粉樣蛋白沉積和神經(jīng)新生的影響

    2011-06-12 11:01:48田元元商超蔚李林英王慧宇苗云飛亢園園賀維亞
    關(guān)鍵詞:蛋白酶體泛素陽性細(xì)胞

    高 林 田元元 薛 春 商超蔚 李林英 王慧宇 苗云飛 亢園園 賀維亞

    河南大學(xué)臨床學(xué)院 開封 475000

    阿爾茨海默?。ˋlzheimer's disease,AD)的病理改變以腦組織內(nèi)出現(xiàn)老年斑、神經(jīng)原纖維纏結(jié)及神經(jīng)元丟失為特征。而Aβ的沉積是其發(fā)病的中心環(huán)節(jié)[1]。另外,Dickson等人報(bào)道[2],正常老年人尸檢也能見到老年斑,但卻未發(fā)病,看來AD和正常老年人之間并無質(zhì)的區(qū)別。為此,我們認(rèn)為這可能與腦內(nèi)異常蛋白的處理、降解β淀粉樣蛋白的處理能力(也即泛素-蛋白酶體系統(tǒng))不同有關(guān)。筆者采用腹腔注射泛素-蛋白酶體抑制劑,建立腦內(nèi)淀粉樣蛋白沉積大鼠模型,以觀察大鼠行為學(xué)、腦內(nèi)淀粉樣蛋白和神經(jīng)新生的影響,探討阿爾茨海默病的發(fā)病機(jī)制和制定治療策略提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 試劑與藥品:①試劑:尿嘧啶脫氧核苷(bromodeoxyuridine,BrdU)購于美國Sigma公司。BrdU抗體、鏈霉卵白素(SP)染色試劑盒和二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒均購自北京中山試劑公司。②水迷宮(張家港生物醫(yī)學(xué)儀器廠),江灣Ⅰ型C立體定向儀(第二軍醫(yī)大學(xué)),微量注射器(上海華亭精密儀器廠)。

    1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:成年雄性SD大鼠57只,鼠齡2個(gè)月。體質(zhì)量200~300g,平均260g左右,均由鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

    1.2 實(shí)驗(yàn)方法

    1.2.1 學(xué)習(xí)記憶測(cè)試方法:大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,進(jìn)行水迷宮測(cè)試。5次/d,2min/次,共5d。第3d開始記錄逃避潛伏期(大鼠從入水至找到并爬上平臺(tái)所需時(shí)間),一般在第3d動(dòng)物逃避潛伏期均在20s內(nèi)。如在第5天,動(dòng)物逃避潛伏期仍大于20s即作為淘汰指標(biāo)。共淘汰12只動(dòng)物,其中死亡6只,1只視力障礙。造模2個(gè)月后,再次行水迷宮測(cè)試,5次/d,2min/次,共5d,第3天開始記錄逃避潛伏期。

    1.2.2 分組與動(dòng)物模型制備:57只大鼠分別分為實(shí)驗(yàn)組(腹腔注射泛素-蛋白酶體抑制劑)、對(duì)照組和正??瞻捉M等3組,實(shí)驗(yàn)組15只,對(duì)照組15只,空白組15只動(dòng)物。參照Ni等[1]的方法制備大鼠模型(腹腔注射泛素-蛋白酶體抑制劑0.03mg/kg),對(duì)照組給予同體積的生理鹽水。所有大鼠手術(shù)后均置于通風(fēng)的動(dòng)物房飼養(yǎng)60d后,各組進(jìn)行行為學(xué)習(xí)記憶測(cè)試。飼養(yǎng)和造摸期間共淘汰9只(實(shí)驗(yàn)組3只,對(duì)照組4只,空白組2只)。

    1.2.3 免疫組化檢測(cè):①BrdU染色法[3]:腹腔注射Brdu(50 mg/kg),1次/8h,3次/d,連續(xù)注射5d。末次注射24h后經(jīng)左心室常規(guī)灌注多聚甲醛沖洗,常規(guī)固定、脫水、浸蠟、包埋,石蠟切片,層厚約為5μm,免疫染色步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行,腦組織切片用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次,2min/次。DNA變性處理:50%formamide/2×SSC(枸櫞酸鹽水)于65℃下共反應(yīng)2h,傾去液體后以2×SSC沖洗5min;2mol/L鹽酸37℃處理30min;以pH 值為8.5的硼酸緩沖液沖洗后室溫下反應(yīng)10~15min,而后用含10%血清、0.1%Ttiton 100的磷酸鹽緩沖液37℃封閉30min,加入鼠抗Brdu 4℃過夜,磷酸鹽緩沖液沖洗3次,10min/次;加入稀釋的生物素化兔抗小鼠二抗(1∶80),37℃反應(yīng)2h;磷酸鹽緩沖液沖洗3次,5min/次;加入辣根過氧化物酶室溫下反應(yīng)1h后DAB顯色,室溫晾干,二甲苯透明后中性樹膠封片。于光學(xué)顯微鏡下觀察海馬齒狀回神經(jīng)前體細(xì)胞增殖情況。②改進(jìn)的甲醇剛果紅染色:行為學(xué)記憶測(cè)試結(jié)束后,斷頭取腦,用冰凍生理鹽水沖去血漬,置新配4%多聚甲醛固定,常規(guī)脫水、石蠟包埋。取海馬腦組織塊做冠狀切片,常規(guī)脫臘至水,Harris蘇木精染色5~10min,溫水顯藍(lán),自來水沖洗數(shù)分鐘,1%鹽酸酒精分化數(shù)秒鐘,溫水顯藍(lán),自來水沖洗數(shù)分鐘,甲醇剛果紅染色15min,自來水沖洗數(shù)分鐘,0.2%酒精分化數(shù)秒鐘,溫水顯藍(lán),自來水沖洗數(shù)分鐘,常規(guī)脫水、透明、封片。

    1.2.4 半定量分析:每只大鼠隨機(jī)選取6張非連續(xù)腦組織切片,于光學(xué)顯微鏡下任選5個(gè)高倍視野(×200)觀察計(jì)數(shù)雙側(cè)海馬區(qū)BrdU標(biāo)記的陽性細(xì)胞數(shù)量。采用雙盲隨機(jī)法計(jì)算視野中陽性細(xì)胞數(shù)。

    2 結(jié)果

    2.1 學(xué)習(xí)記憶測(cè)試 正常空白組和對(duì)照組大鼠的學(xué)習(xí)記憶測(cè)試結(jié)果比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);實(shí)驗(yàn)組大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力明顯低于正??瞻捉M(P<0.05)。見表1。

    2.2 免疫組化檢測(cè)

    2.2.1 BrdU染色:光學(xué)顯微鏡下觀察顯示,各組大鼠海馬區(qū)BrdU陽性細(xì)胞呈單個(gè)或兩個(gè)分布,細(xì)胞核形態(tài)規(guī)則,主要分布于齒狀回顆粒細(xì)胞層亞顆粒增生帶中(圖1~3)。實(shí)驗(yàn)組大鼠海馬區(qū)BrdU陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)顯著減少,與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

    表1 各組大鼠逃避潛伏期和海馬區(qū)BrdU陽性細(xì)胞數(shù)比較 ()

    表1 各組大鼠逃避潛伏期和海馬區(qū)BrdU陽性細(xì)胞數(shù)比較 ()

    注:實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較,▲P<0.05;與空白組比較,●P<0.05;對(duì)照組與空白組相比較,△P>0.05

    2.2.2 剛果紅染色:對(duì)照組與空白組(圖4)相比,海馬區(qū)可見神經(jīng)元旁有少量的染色陽性物質(zhì),其周圍神經(jīng)元形態(tài)基本正常,細(xì)胞排列層次稍有紊亂(圖5)。實(shí)驗(yàn)組與空白組相比,海馬區(qū)可見神經(jīng)元旁有大量的染色陽性物質(zhì),其周圍神經(jīng)元皺縮,細(xì)胞排列層次明顯紊亂,可見明顯的膠質(zhì)細(xì)胞浸潤(圖6)。

    3 討論

    β-APP(β-amyloid precursor protein)是一種跨膜蛋白,廣泛表達(dá)在各種類型和腦各部分的神經(jīng)元,生理情況下合成后的APP僅10%成為跨膜蛋白,大部分在胞內(nèi)被α-分泌酶水解生成具有明顯神經(jīng)營養(yǎng)作用的可溶性 Appα[4-5]。同時(shí)β-APP也是一種應(yīng)激蛋白,在有害刺激作用下,β-APP表達(dá)上調(diào),Aβ生成增加而可溶性Appα減少。但正常情況下機(jī)體修復(fù)機(jī)制可以及時(shí)降解應(yīng)激時(shí)產(chǎn)生的Aβ而避免其累積[6-7]。

    泛素-蛋白酶體系統(tǒng)(ubiquitin-proteasome sytem,UPS)是真核細(xì)胞內(nèi)重要的非溶酶體蛋白降解通路。UPS能夠利用其末端76位的甘氨酸與目的靶蛋白的α或ε-氨基共價(jià)結(jié)合,使目的蛋白能夠帶上泛素化標(biāo)記,以便進(jìn)一步降解。細(xì)胞內(nèi)蛋白的泛素化作用參與了多種細(xì)胞生物學(xué)功能,例如細(xì)胞周期進(jìn)程、細(xì)胞增生與分化、細(xì)胞凋亡等[8]。在UPP中E3連接酶是其選擇性降解機(jī)制的關(guān)鍵因素,能夠?qū)b、底物蛋白還有26S蛋白酶體連接起來,起到了橋梁的作用。UPP中E3連接酶的數(shù)量眾多,有研究表明,其中多種E3連接酶如parkin、HRD1、CHIP等都能夠參與調(diào)控AD中兩個(gè)重要效應(yīng)分子tau蛋白和Aβ的降解[9-10]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,腹腔注射泛素-蛋白酶體抑制劑2個(gè)月后,空白組未發(fā)病,說明空白組修復(fù)機(jī)制是正常的,可以降解或吞噬大量的Aβ而避免其沉積發(fā)揮神經(jīng)毒性,保護(hù)了周邊的神經(jīng)元。而實(shí)驗(yàn)組結(jié)果說明機(jī)體的修復(fù)機(jī)制存在障礙,沉積的淀粉樣蛋白使得其周邊的神經(jīng)元皺縮或丟失,從而表現(xiàn)出行為學(xué)習(xí)記憶障礙。本實(shí)驗(yàn)提示我們:泛素蛋白酶體系統(tǒng)衰退,促使了淀粉樣的沉積。

    在本實(shí)驗(yàn)中,經(jīng)尿嘧啶脫氧核苷標(biāo)記染色后顯示實(shí)驗(yàn)組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)前體細(xì)胞增殖能力明顯下降,分析原因可能與淀粉樣蛋白沉積對(duì)大鼠海馬區(qū)神經(jīng)前體細(xì)胞的增殖有抑制作用,這與體內(nèi)[8]和體外[11-12]實(shí)驗(yàn)研究淀粉樣蛋白對(duì)PC12細(xì)胞的增殖有抑制作用相一致。至于淀粉樣蛋白對(duì)神經(jīng)前體細(xì)胞的抑制作用是通過什么信號(hào)傳導(dǎo)途徑需進(jìn)一步研究和探討。

    圖1 空白組海馬區(qū)Brdu陽性細(xì)胞數(shù)(×200)

    圖2 對(duì)照組海馬區(qū)Brdu陽性細(xì)胞數(shù)(×200)

    圖3 實(shí)驗(yàn)組海馬區(qū)Brdu陽性細(xì)胞數(shù)(×200)

    圖4 空白組海馬區(qū)淀粉樣蛋白沉積的變化(×200)

    圖5 對(duì)照組海馬區(qū)淀粉樣蛋白沉積的變化(×200)

    圖6 實(shí)驗(yàn)組海馬區(qū)淀粉樣蛋白沉積的變化(×200)

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