慢性腦缺血大鼠OXR表達(dá)的實(shí)驗(yàn)分析

呂 斌 婁季宇 張 萍 李文杰

1）河南省食品藥品檢驗(yàn)所 鄭州 450003 2）鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院 鄭州 4500143）鄭州市第一人民醫(yī)院 鄭州450002 3）鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院 鄭州 450001

本文通過(guò)結(jié)扎雙側(cè)的頸總動(dòng)脈法，建立慢性腦缺血大鼠模型，觀察大鼠腦組織OX1R、OX2R的表達(dá)及其隨時(shí)間變化的情況，探討其引起改變的意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和主要試劑 SPF級(jí)SD大鼠月齡12～14個(gè)月，體質(zhì)量300～350g，雄雌不限，由鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。山羊抗多克隆OX1R抗體、OX2R抗體500μg／mL，購(gòu)自Santa Cruz公司，SP免疫組化試劑盒（山羊）購(gòu)自北京中山生物試劑公司。其他試劑為進(jìn)口分裝優(yōu)級(jí)純。

1.2 慢性腦腦缺血大鼠模型建立及實(shí)驗(yàn)分組 參照Ohta等［1］方法制作慢性腦缺血大鼠模型。大鼠術(shù)前12h禁食，4 h禁水。用1%戊巴比妥鈉（10mg／kg）腹腔進(jìn)行注射麻醉，保證在手術(shù)期間有自主呼吸。仰臥固定，頸前部去毛消毒后，沿頸正中切開(kāi)，分離出雙側(cè)頸總動(dòng)脈，雙重絲線給與結(jié)扎，術(shù)中大鼠肛溫保持在36.5℃～37.5℃，手術(shù)后動(dòng)物送至有通風(fēng)和空調(diào)設(shè)備的動(dòng)物房飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為正常組、假手術(shù)組、模型組，正常組不予處理常規(guī)飼養(yǎng)，假手術(shù)組動(dòng)物僅行頸前切開(kāi)，不結(jié)扎頸總動(dòng)脈，模型組又分為15d、1個(gè)月、2個(gè)月共3個(gè)亞組，均在相同的時(shí)間點(diǎn)處死。每組各12只。

1.3 大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力測(cè)試結(jié)果 采用水迷宮法，進(jìn)行大鼠記憶功能的測(cè)定。各組大鼠手術(shù)前先進(jìn)行訓(xùn)練。正式訓(xùn)練前先將大鼠放在安全臺(tái)的附近，讓其自行游上安全臺(tái)2次，然后再分別從中間點(diǎn)、起點(diǎn)各讓其自由游上安全臺(tái)，進(jìn)行預(yù)訓(xùn)練，去除靈活性過(guò)差的大鼠，對(duì)其余大鼠進(jìn)行正式訓(xùn)練，直到大鼠連續(xù)3次從起點(diǎn)到達(dá)終點(diǎn)，游迷宮所需時(shí)間差＜10 s，錯(cuò)誤次數(shù)＜1次，即為訓(xùn)練成功。對(duì)已經(jīng)過(guò)訓(xùn)練的大鼠，分別于術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)再次游迷宮，衡量該大鼠記憶功能，以大鼠自迷宮起點(diǎn)至安全臺(tái)終點(diǎn)所需時(shí)間（即逃避潛伏期）為衡量記憶功能的指標(biāo)，連測(cè)10次，取其平均值。

1.4 腦組織切片制備和腦組織OXR表達(dá)測(cè)定、OX1R雙標(biāo)免疫熒光測(cè)定 各組動(dòng)物達(dá)到規(guī)定的時(shí)間點(diǎn)時(shí)，采用10%水合氯醛麻醉（3～5mL／kg），用20mL的注射器接穿刺針，小心插入左心室，同時(shí)剪開(kāi)右心耳，注入滅菌過(guò)的溫生理鹽水，直至流出的液體變清后，再灌注4%多聚甲醛0.1mol／L PBS（pH 7.2）約60mL，再斷頭取腦，之后，置4%多聚甲醛0.1mol／L PBS固定液，浸泡8h，作常規(guī)固定、石蠟包埋，連續(xù)冠狀切片，片厚為2μm。取2張連續(xù)切片，分別用于OX1R、OX2R抗體進(jìn)行免疫組化染色。應(yīng)用SP染色試劑盒，進(jìn)行免疫組化染色，操作步驟參照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。一抗?jié)舛葹榉謩e為1∶200、1∶100，4℃過(guò)夜；滴加生物素化二抗，37℃孵育20min；滴加試劑SP，37℃孵育20min，DAB顯色，鏡下控制時(shí)間，光鏡觀察，鏡下計(jì)數(shù)。采用盲法計(jì)數(shù)，OX1R主要表達(dá)于CA1區(qū)，OX2R主要表達(dá)于CA3區(qū)［5］，OX1R每張切片的皮層、海馬CA1區(qū)，OX2R每張切片的皮層、海馬CA3區(qū)計(jì)數(shù)5個(gè)視野1000個(gè)細(xì)胞，數(shù)出陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。

雙標(biāo)免疫熒光測(cè)定取15d模型組部分切片，嚴(yán)格按照雙標(biāo)免疫熒光步驟對(duì)OX1R抗體進(jìn)行雙標(biāo)免疫熒光測(cè)定，在激光共聚焦顯微鏡（日本OLYMPUS，F(xiàn)V300）下觀察OX1R的表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 行為學(xué)評(píng)價(jià) 結(jié)果表明，假手術(shù)組的逃避潛伏期［（38.146±13.232）s］與正常組［（32.427±19.206）s］比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），且與其他各組比較的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異結(jié)果均一致。模型組15d逃避潛伏期（96.502±25.571）s，較正常組顯著延長(zhǎng)（P＜0.01），說(shuō)明缺血15d時(shí)大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力有明顯減退。模型組1個(gè)月逃避潛伏期［（74.607±26.543）s、2個(gè)月（67.834±27.350）s］與模型組15d比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。說(shuō)明隨著距離缺血時(shí)間點(diǎn)遠(yuǎn)離，大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力較15d模型有所好轉(zhuǎn)；與正常組進(jìn)行比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；模型組2個(gè)月逃避潛伏期與模型組1個(gè)月比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。說(shuō)明模型組仍未能達(dá)到正常組水平；模型組2個(gè)月較1個(gè)月學(xué)習(xí)記憶能力進(jìn)一步好轉(zhuǎn)。

2.2 OX1R、OX2R的表達(dá) 見(jiàn)表1。結(jié)果顯示：模型組15d時(shí)的OX1R的表達(dá)與正常組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；15d后明顯下降，1個(gè)月時(shí)與正常組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；2個(gè)月時(shí)與模型組15d差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 皮層、海馬CA1區(qū)OX1R及皮層、海馬CA3區(qū)OX2R陽(yáng)性表達(dá)的細(xì)胞數(shù)

2.3 各組大鼠海馬周圍神經(jīng)纖維OX2R表達(dá)的平均灰度值比較 見(jiàn)表2。15d時(shí)神經(jīng)纖維的著色與正常組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。（P＜0.01）；1個(gè)月時(shí)與15d時(shí)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），與正常組比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；2個(gè)月時(shí)與1個(gè)月比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與模型組15d比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)（P＜0.01）。

表2 各組大鼠海馬周圍神經(jīng)纖維OX2R表達(dá)的平均灰度值比較

2.4 模型組15d時(shí)海馬CA1區(qū)，OX1R的雙標(biāo)免疫熒光 見(jiàn)圖1～圖3。NSE是標(biāo)記神經(jīng)元特異性抗體，由此證明OX1R確實(shí)可以表達(dá)于神經(jīng)元。

圖1 一抗為山羊抗大鼠OX1R抗體，二抗兔抗山羊CY3標(biāo)記的熒光圖片（紅色）

圖2 一抗為小鼠抗大鼠NSE抗體，二抗為羊抗小鼠FITC標(biāo)記的熒光圖片（綠色）

圖3 激光共聚焦顯微鏡下的雙標(biāo)圖片（黃色）

3 討論

Orexin及其受體的生理功能與攝食、調(diào)節(jié)營(yíng)養(yǎng)與能量平衡、睡眠覺(jué)醒周期、神經(jīng)內(nèi)分泌及行為等多方面因素有關(guān)［3］。Irving等的研究發(fā)現(xiàn)，急性大鼠腦缺血時(shí)OX1R表達(dá)會(huì)增高［2］。本研究采用免疫組化法，觀察慢性缺血性腦損傷，發(fā)現(xiàn)OXR表達(dá)會(huì)隨缺血時(shí)間的改變而變化，表明orexin系統(tǒng)與慢性缺血性腦損傷的相關(guān)病理過(guò)程有關(guān)，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

腦組織缺血早期，機(jī)體各種因素首先刺激下丘腦Orexin釋放表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)NPY、皮質(zhì)激素釋放因子、ACTH的升高，導(dǎo)致糖皮質(zhì)激素、腎上腺素增加，體內(nèi)自主神經(jīng)系統(tǒng)過(guò)度活化。然而大量的CRH、糖皮質(zhì)激素和NPY會(huì)對(duì)下丘腦Orexin產(chǎn)生強(qiáng)烈的抑制作用，加上自由基的破壞作用，最終使Orexin表達(dá)能力下降。因此，會(huì)從腦缺血的急性期持續(xù)到15dOXR表達(dá)的增高。缺血15d后，免疫和應(yīng)激反應(yīng)減弱，CRF、糖皮質(zhì)激素、自由基和NPY水平會(huì)下降，Orexin表達(dá)能力開(kāi)始上升，恢復(fù)新的平衡［4］。OXR表達(dá)下降，在1m時(shí)較15d時(shí)明顯下降。在腦缺血的后期，機(jī)體會(huì)促進(jìn)修復(fù)下丘腦OXR的表達(dá)，因此缺血1個(gè)月后OXR逐漸增多，腦缺血2m時(shí)明顯升高。

從組織學(xué)角度看，腦缺血15d時(shí)部分神經(jīng)細(xì)胞將萎縮、缺血1m時(shí)大部分神經(jīng)細(xì)胞體積有縮小現(xiàn)象、胞核濃縮、深染、結(jié)構(gòu)不清。在腦缺血2個(gè)月時(shí)部分細(xì)胞形態(tài)基本恢復(fù)正常。從信號(hào)傳導(dǎo)角度分析，Orexin系統(tǒng)在慢性缺血性腦損傷的病理過(guò)程中，起到雙向調(diào)控的作用。腦缺血的早期Orexin與OXR結(jié)合后，通過(guò)Gq信號(hào)途徑與磷脂酶C（PLC）產(chǎn)生偶聯(lián)，能激活細(xì)胞膜上的PLC，進(jìn)而催化質(zhì)膜磷脂酰肌醇二磷酸（PIP2）的水解，生成三磷酸肌醇（IP3）和二酰基甘油（DAG）。細(xì)胞內(nèi)Ca2＋超載，鈣蛋白酶被過(guò)度激活，引起其底物蛋白的過(guò)度降解，使細(xì)胞周期停止在G2期，導(dǎo)致細(xì)胞損傷或凋亡［5］。腦缺血后期OXR激活了Gs的信號(hào)途經(jīng)，激活cAMP依賴的蛋白激酶，使cAMP含量升高，促進(jìn)下游基因產(chǎn)物如腦源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子、Bcl－2、c－Fos等的表達(dá)，促進(jìn)缺血后神經(jīng)細(xì)胞的存活和再生［6］。

OX1R在腦內(nèi)分布很廣泛，大鼠的海馬、皮層、下丘腦等部位均能OX1R表達(dá)，而OX1R主要表達(dá)于神經(jīng)細(xì)胞的胞漿和胞膜，部分膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)也有OX1R表達(dá)。膠質(zhì)細(xì)胞能為神經(jīng)細(xì)胞的再生提供充足的營(yíng)養(yǎng)，提示膠質(zhì)細(xì)胞的OX1R表達(dá)可能會(huì)有神經(jīng)保護(hù)作用。NSE是特異標(biāo)記神經(jīng)元的抗體，本研究通過(guò)雙標(biāo)免疫熒光證實(shí)OX1R的確在神經(jīng)元有表達(dá)，與已往研究相一致。

本研究還發(fā)現(xiàn)，OX2R除表達(dá)于上述部位神經(jīng)元外，在皮層的深層也有表達(dá)，而OX1R沒(méi)有這種表達(dá)，這在以前的研究中未曾見(jiàn)過(guò)報(bào)道。原位雜交結(jié)果表明OX1R和OX2R mRNA的分布有顯著差異，其原因可能為OX2R在皮層的表達(dá)主要在皮質(zhì)的深層，而神經(jīng)纖維主要集中在皮質(zhì)的深層，所以O(shè)X2R有較強(qiáng)的神經(jīng)纖維著色。

OXR在慢性腦缺血的表達(dá)及其變化揭示了腦神經(jīng)細(xì)胞損傷、修復(fù)的整個(gè)變化過(guò)程。腦缺血時(shí)細(xì)胞形態(tài)的變化及記憶能力明顯下降，均支持OXR與神經(jīng)細(xì)胞的凋亡有一定關(guān)系，與Voisin等［7］的研究結(jié)果相符。而缺血2月時(shí)部分細(xì)胞形態(tài)的恢復(fù)，及2月時(shí)大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力的明顯好轉(zhuǎn)，可能與OX2R介導(dǎo)的細(xì)胞保護(hù)作用有關(guān)，與Katsuki等［8］的研究結(jié)果一致。因此OXR在慢性腦缺血中起雙向調(diào)節(jié)作用，其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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